產品及特點

超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌(ESBL-Escherichia coli)是一種在醫院內感染的常見機會致病菌，各臨床科室以及標本類型中均有檢出，科室分布以普外科為主，標本類型以傷口分泌物標本為主，常引起外殼感染性疾病，該細菌對多種抗生素有較強的耐藥性，所以醫院要加強對該細菌的耐藥性的檢測與監控，積極做好細菌的培養和藥物敏感性試驗，規范合理使用抗生素，以控制耐藥菌的出現和流行，因此快速檢測超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的試劑盒，它具有下列特點：

• 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
• 引物和探針經過優化，靈敏性高。
• 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
• 特異性高，引物是根據人超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌高度保守的VP1區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。
• 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
• 本產品只能用于科研。

規格及成分

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

自備試劑

樣品DNA。

使用方法

一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

• 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
• 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
• 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
• 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
• 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
• 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

• 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
• 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數細菌DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細菌DNAout或柱式細菌DNAout。本試劑盒免費贈送50次免DNA提取的天凈沙DNA釋放劑，本產品的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

• 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。
• 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

• 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

五、數據處理

• 以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測

• 如果有必要電泳確認，可取10-20μL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環境，建議不輕易采納。

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