MTT法檢測細胞活性步驟及原理

要知道MTT法檢測細胞活性步驟先要知道MTT是什么？

MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。

MTT法檢測細胞活性原理

檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。
 

MTT法檢測細胞活性步驟

A.Hela細胞復蘇

1.從液氮容器中取出從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化；
2.從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上DEME培養(yǎng)液，混勻；
3.離心，1000rpm，5min；
4.棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，計數，調整細胞密度1×104個/mL，部分接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
5.次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后定期更換培養(yǎng)液，維持細胞正常活性。
 

B.MTT檢測復蘇細胞的細胞活性

Hela細胞計數用血細胞計數板的四個角上的方塊。

1.接種培養(yǎng)瓶同時，將其余部分接種于96孔細胞培養(yǎng)板，7組，每組5孔，每孔100μL,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
2.培養(yǎng)24h后，向每孔內加入用磷酸緩沖液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培養(yǎng)箱內培育；
3.4h后終止培養(yǎng)，將孔內培養(yǎng)液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。同時每行的一孔設置為調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。用酶標儀OD570nm處測量各孔吸光值；
 

C.細胞生長曲線制作

接B.2，B.3步驟，連續(xù)測量7天，根據測量結果繪制細胞生長曲線。
[橫坐標生長時間，縱坐標吸光度值。]

D.探究某藥物對于細胞活性的影響

1.將之前培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的細胞用0.5%胰蛋白酶洗脫，加入DEME培養(yǎng)液制成細胞密度為1×106個/mL的細胞懸液；
2.設置空白對照組及5個不同藥物梯度的實驗組，分別加載96孔培養(yǎng)板內（5個梯度劑量按藥物種類待定），每個劑量分別設置5個平行孔，每孔加入細胞懸液100μL（在加藥的前下午完成鋪板）；
3.次日上午按預先設置的藥物梯度加藥，后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h（若藥物能與MTT反應，可以先離心后棄去上清液，用PBS沖洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液；
6.每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，用酶標儀OD490nm處測量各孔的吸光度；
7.同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

E.Hela細胞凍存?

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2.取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接細胞移15ml離心管中；
3.離心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節(jié)凍存液中細胞的終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5.將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5?ml；
6.在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
7.凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/?min；當溫度達-25℃以下時，可增-5℃～-10
℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

MTT法檢測細胞活性其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。MTT法檢測細胞活性該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。