準備工作

（1）試管、試管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、燒杯、橡皮頭、剪刀、鑷子、紗布、棉球、酒精燈、滴管、移液器、細胞計數器、生理鹽水、PBS、雙抗（青鏈霉素）、75%酒精、95%酒精、培養瓶（50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周齡，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（滅活）、DMEM-LG培養液（美國GIBCO）

（3）針頭與注射器：4.5號、7號針頭（沖小鼠股骨、脛骨和肱骨骨髓，制單細胞懸液）。

實驗前準備

（1）實驗室消毒，隔離衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培養液，加雙抗（內含青霉素、鏈霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭無菌操作臺面，取各種已消毒的培養用品置于超凈臺面，無菌室及超凈臺用紫外燈照射30~60 分鐘滅菌。

（3）開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔離衣，戴手套。用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風機運轉10 分鐘后，才可開始實驗操作。點燃酒精燈，安裝吸管帽。

實驗步驟

（1）BALB/C純系小鼠脫臼處死后，75%乙醇浸泡5min后，在無菌操作臺上無菌條件下分離雙側股骨及脛骨，在含生理鹽水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周圍肌肉組織，剪去包括骺板在內的兩側骺端，用10ml注射器（配4.5號針頭）抽取適量含10%FBS的*培養基沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養瓶。依次用7號針頭和4.5號針頭（或依次過21、23、25號）反復吹打骨髓細胞懸液，制成單細胞懸液。細胞懸液在1000rpm離心5min后收集細胞或進行密度梯度離心。

（2）將單細胞懸液于1:2比例加到含1.082比重Percoll細胞分離液的離心管中，4℃條件下，經500g密度梯度離心25min，小心收集離心液界面上乳白色云霧狀的單核細胞層，加入等量無血清培養基或磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌（500g離心5min或180g離心10min）2次，去上清，用10%FBS的培養基懸浮細胞（用0.83%氯化胺破碎紅細胞，培養液重懸細胞）。注意：密度梯度離心力500g×30min組優于800g×30min。本步驟可以省略。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手術肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混勻后，保存于4℃冰箱，24小時內分離骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培養液）混勻后，以1份淋巴細胞分離液上面加2份稀釋骨髓的比例，將稀釋骨髓緩慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平離心機20℃條件下500g（2000r/min）離心25~30分鐘。從界面上取出的MNC用PBS液洗滌2~3次后，加適量培養液計數。

（3）數細胞數量，達到106~107/ml后即進行原代培養，按5×106/ml濃度接種于50ml培養瓶中（1×106/cm2培養瓶），每瓶含5ml L-DMEM*培養液。在體積分數為5%的CO2和37℃條件下靜止培養，3d后換液去除非貼壁細胞，以后每3~4d半量換液1次，10~12d細胞達90%融合時傳代。

（4）傳代培養：傳代時先全部吸出培養液后，用無Ca2+ 、Mg2+PBS液洗滌二次，加入37℃預熱的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化1~2分鐘，吸去胰酶，以殘留的胰酶繼續消化，倒置顯微鏡下觀察，細胞開始皺縮時（細胞開始變圓）加入*培養液（3ml左右）終止胰酶作用。吸管反復吹打后將細胞收集于15ml離心管中，1500r/min 離心10分鐘后棄上清，再用PBS液洗滌二次*洗去混有的胰蛋白酶。

將細胞再懸浮于培養液中，按2~5×105/ml再次接種傳代于新的培養瓶中。當這些細胞生長接近融合層時，即得到骨髓MSC。傳至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接種于放置有蓋玻片的6孔板內，以制備細胞爬片。

注：貼壁細胞的消化，應掌握各類型細胞不同的消化時間，避免過度消化，損傷細胞活力；或消化不足，不能充分解離成單細胞。如為長期實驗，每個月重新復蘇一支細胞，避免長期傳代引起細胞特性變異。