產品及特點 牛細小病毒(Bovine Parvovirus,BPV) 會引發牛細小病毒感染，是一種接觸性傳染病,以下痢為主要癥狀,其特征是母牛生殖機能障礙，導致妊娠母牛感染導致流產、死胎，犢牛感染則表現腸炎、腹瀉。牛細小病毒感染在牛群中發生比較廣泛，目前國內外對其研究的較少,發生此病的國家也不多，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測牛細小病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據牛細小病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的DNA發生交叉反應。

5.本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

6.本產品只能用于科研。

規格及成分 成分 編號 十孔盒包裝

2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）

熒光PCR模板稀釋液 180701 1 mL（黃蓋）

牛細小病毒 PCR引物 15-44000yw 100 μL（白蓋）

牛細小病毒 qPCR探針 15-44000pro 100 μL（棕色管）

牛細小病毒陽性對照2.0

(1×10E8拷貝/μL) 15-44000pc 50 μL（紅蓋）

天凈沙核酸釋釋劑試用裝 61202 50次（2.5mL）

使用手冊 15-44000sc 1份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

自備試劑 樣品DNA。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分 樣品管

N+2個 PCR陰性對照管 標準曲線

樣品管（2-7管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL

牛細小病毒 qPCR探針 2 μL 2 μL 各2 μL

牛細小病毒 PCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL

 待測樣品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） 不加 不加 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程 溫度 時間

預變性 94℃ 5 min

PCR反應

（40個循環） 94℃ 0.5 min

55℃ 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號）

72℃ 0.5 min

后延伸 72℃ 10min

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

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