小鼠子宮頸癌細(xì)胞胞培養(yǎng)步驟
培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1)準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基(DMEM, GIBCO,貨號11965-092),90%;胎牛血清,10%
2)培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37C,培并箱濕度為709%-80%。
凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存
有1mlL細(xì)抱縣液的凍存管迅速放入37C水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖売解凍,移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)
基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞縣液移入含有5ml
2)細(xì)胞傳代:如県細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)
參考以下方法
含鈣、鎂離子的
2加ロ2m消化液(0.25% Trypsin-0.53 MM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37C培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯徹鏡下觀察細(xì)抱消化情況
若細(xì)胞大部分變返并脫落,迅速拿回操作臺,輕幾下培養(yǎng)瓶后加入3m比細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。
輕輕吹打后吸出,移入15ml離心管中,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)液后吹勻
4.移入到事先準(zhǔn)音好的含有5m培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14m培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方
的1-3步驟進(jìn)行,*的重縣液使用血清。是浮細(xì)抱直接計(jì)數(shù)后離心,用血清重浮,か加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混
勻,按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。