大腸桿菌類感受態細胞XL2-Blue操作說明書

操作步驟 （以下操作均按無菌條件的標準進行）

1. 取感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞 懸液分裝到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。 注意： 一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100 μl， 可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA體積不 要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以 100 μl感受態細胞為例。

2. 向感受態細胞懸液中加入目的DNA（100 μl的感受態 細胞能夠被1 ng超螺旋質粒DNA所飽和)，輕彈混勻， 在冰浴中靜置30 min。

3. 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速將 管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3 min，該過程不要搖 動離心管。 注意：此步驟也可將離心管置于室溫進行，時間不需 十分準確，夏季或室溫較高時，可放置5-8 min左右， 如果室溫較低，可延長時間至8-15 min左右。條件允 許建議使用42℃熱激方法。

4. 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC或LB培養基 （不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養45 min (150 rpm)，目的是使質粒上相關的抗性標記基因 表達，使菌體復蘇。

5. 將離心管內容物混勻，吸取100 μl已轉化的感受 態細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂 培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻 涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平 板，37℃培養12-16 h。 注意：涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化 的DNA總量較多，可取更少量轉化產物涂布平 板；反之，如轉化的DNA總量較少，可取200- 300 μl轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較 少，可通過離心（4000 rpm, 2 min）后吸除部 分培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。 （涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉 化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養 板）

注意事項：  
 1、感受態細胞應保存在-70 ℃，不可反復凍融，否則其轉化效率將會降低。  
 2、實驗過程中應嚴格無菌操作，防止其它 DNA的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。  
 3、轉化時，轉化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉化效率。轉化時DNA體積要小于感受態細胞體積的十分之一。  
 4、轉化率的計算：轉化率＝產生菌落的總數/ 鋪板DNA總量。  
 5、為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接產物，以重新轉化，將損失降到低