精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）細(xì)胞流式儀檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）細(xì)胞流式儀檢測(cè)試劑是一種旨在使用透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于動(dòng)物和人體精子細(xì)胞的活性氧族的檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過細(xì)胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。 

產(chǎn)品內(nèi)容

 高純液（Reagent A）    毫升

 低純液（Reagent B）    毫升

 保存液（Reagent C）    毫升

 染色液A（Reagent D）    微升

 染色液B（Reagent E）    微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 高純液（Reagent A）和 低純液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液A和B（Reagent D和E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于樣品孵育

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞流式儀：用于分析染色的精子細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品預(yù)處理

• 移取2毫升新鮮收集（48小時(shí)內(nèi)）的精液到2毫升離心管
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘（注意：可以離心后加入 保存液（Reagent C）后，直接染色檢測(cè)）——此為純精液精子細(xì)胞
• 準(zhǔn)備一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升 高純液（Reagent A）
• 小心加入xx毫升 低純液（Reagent B）在上述 高純液（Reagent A）的上面（注意：避免震蕩）
• 小心加入xx毫升精液在上述 低純液（Reagent B）的上面（注意：避免震蕩）
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為300g
• 小心移取 高純液（Reagent A）和 低純液（Reagent B）交界面上的精子細(xì)胞——此為不成熟精子細(xì)胞（注意：如果檢測(cè)不成熟精子細(xì)胞，可以加入 保存液（Reagent C）保留）
• 小心移取管底精子細(xì)胞顆粒群到新的1.5毫升離心管——此為成熟精子細(xì)胞
• 加入xx毫升 保存液（Reagent C），混勻成熟精子細(xì)胞顆粒群
• 充分混勻后，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 調(diào)整精子細(xì)胞數(shù)為1 X 10⁶/毫升
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時(shí)內(nèi)）

• 細(xì)胞流式儀分析

• 加入xx微升 染色液A（Reagent D）到上述制備的500微升1 X 10⁶/毫升的精子細(xì)胞，混勻
• 加入xx微升 染色液B（Reagent E）到上述制備的500微升1 X 10⁶/毫升的精子細(xì)胞，混勻
• 室溫（25℃）下孵育40分鐘，避免光照
• （選擇步驟）放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• （選擇步驟）加入xx毫升 保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀雙通道分析：觀察至少10000個(gè)精子細(xì)胞以上

• 細(xì)胞流式儀檢測(cè)純精液樣品精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧參考圖像如下

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（500微升體系）操作
• 操作時(shí)須戴手套
• 用戶根據(jù)需要進(jìn)行純精液精子細(xì)胞、不成熟或成熟精子細(xì)胞的檢測(cè)分析
• 如果純精液樣品中含有1 X 10⁶白細(xì)胞/毫升，不宜進(jìn)行純精液精子細(xì)胞活性氧檢測(cè)
• 樣品檢測(cè)前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)10⁴。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：

1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 10⁴（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升

• 染色完成后，即刻進(jìn)行檢測(cè)分析，否則影響檢測(cè)
• 使用向前散射光（forward angle light scatter）選擇性排除精子細(xì)胞殘?jiān)途蛹?xì)胞集聚顆粒
• 建議使用100精子細(xì)胞/秒流速為佳
• 本產(chǎn)品也可用于凍存精子細(xì)胞的檢測(cè)分析
• 正常純精液樣品的精子細(xì)胞活性氧陽性率較低，通常為小于4%
• 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰