蛋白質印跡分析（Western Blot Analysis）

【實驗目的】
了解蛋白質印跡法的基本原理及其操作和應用。

【實驗原理】
蛋白質印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質的免疫化學技術方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經過一定的分離和純化,另外這項技術的應用需要利用待測蛋白的單克隆或多克隆抗體進行識別。
如圖所示，可溶性抗原，也就是待測蛋白首先要根據其性質，如分子量，分子大小，電荷以及其等電點等采用不同的電泳方法進行分離；通過電流將凝膠中的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗體（一抗）與抗原發生特異性結合的原理，以抗體作為探針釣取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前應首先加入非特異性蛋白，如牛血清白蛋白對膜進行“封阻”而防止抗體與膜的非特異性結合。
經電泳分離后的蛋白往往需再利用電泳方法將蛋白質轉移到固相載體上,我們把這個過程稱為電泳印跡。常用的兩種電轉移方法分別為:
1.半干法: 凝膠和固相載體被夾在用緩沖溶液浸濕的濾紙之間,通電時間為10分鐘~30分鐘。
2.濕法：凝膠和固相載體夾心浸放在轉移緩沖溶液中，轉移時間可從45分鐘延長到過夜進行。
由于濕法的使用彈性更大并且沒有明顯浪費更多的時間和原料，因此我們在這里只描述濕法的基本操作過程。
對于目的蛋白的識別需要采用能夠識別一抗的第二抗體。該抗體往往是購買的成品，已經被結合或標記了特定的試劑，如辣根過氧化物酶。這種標記是利用辣根過氧化物酶所催化的一個比色反應，該反應的產物有特定的顏色且固定在固相載體上，容易鑒別。因此可通過對二抗的識別而識別一抗，進而判斷出目標蛋白所在的位置。其他的識別系統包括堿性磷酸酶系統和¹²⁵I標記系統。

【實驗操作】

⒈.蛋白質的分離

根據目的蛋白的性質，利用電泳方法將其進行分離。為提高電轉移的效率，通常采用SDS/PAGE技術。
分離實驗結束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個小口以便定位，小心放入轉移緩沖溶液中待用。

⒉.電轉移

⑴ 準備PVDF膜
根據膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉移緩沖溶液中待用。


夾心放置順序
⑵ 制作膠膜夾心
在一淺盤中打開轉移盒，將一個預先用轉移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經轉移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉移緩沖溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關閉轉移盒。將轉移盒按照正確的方向放入轉移槽中，轉移盒的黑色篩孔板貼近轉移槽的黑色端，轉移盒的白色篩孔板貼近轉移槽的白色端，填滿轉移緩沖溶液同時防止出現氣泡。
⑶ 電轉移
連接電源,在4°C條件下維持恒壓100v，1小時
⒊.免疫檢測
⑴ 膜染色
斷開電源，將轉移盒從轉移槽中移出，將轉移盒的各個部分分開。用鑷子將PVDF膜小心放入一個干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進行短暫清洗，從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個干凈的容器中。將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘,確定蛋白質已經轉移到PVDF膜上。
⑵ 膜的封閉和清洗
對于沒有進行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶液,加入3%封閉緩沖溶液,輕輕搖動至少1小時。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗3次, 每次5分鐘。
⑶ 一抗
倒掉TBS緩沖溶液，加入10 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗，輕輕搖動1小時以上。從容器中倒出一抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。
⑷ 二抗
倒出TTBS 緩沖溶液，加入5 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動30分鐘，倒出二抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。
⑸ 檢測
倒掉TTBS 緩沖溶液，并加入顯影劑，輕輕搖動PVDF膜，觀察顯影情況，當能夠清晰的看到顯色帶時，用蒸餾水在30分鐘內分三次清洗PVDF膜以終止顯色反應的繼續進行。
【實驗結果】
檢查膜上顯色結果，藍紫色帶所對應的即是目標蛋白的位置。

實驗材料】

1. 實驗器材

SDS/PAGE實驗相關材料；電轉移裝置；供電設備；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 紙；其他工具：鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤。

⑴ 10x轉移緩沖溶液（1L）：30.3g Trizma base（0.25M）, 144 g甘氨酸（1.92M）,加蒸餾水至1L, 此時pH約為8.3，不必調整。

⑵ 1x轉移緩沖溶液（2L）：在1.4L蒸餾水中加入400 ml甲醇及200 ml10x 轉移緩沖溶液。

⑶ TBS 緩沖溶液:將1.22g Tris （10 mM）和8.78g NaCl（150 mM）加入到1L蒸餾水中，用HCl調節pH至7.5。

⑷ TTBS buffer：在1L TBS 緩沖溶液中加入0.5ml Tween 20（0.05%）。

⑸ 一抗：兔抗待測蛋白抗體（多克隆抗體）。

（6） 二抗：辣根過氧化物酶標記羊抗兔。

⑺ 3% 封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C 保存以防止細菌污染。

⑻ 0.5%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C 保存以防止細菌污染。

⑼ 顯影試劑：1ml 氯萘溶液 （30mg/ml甲醇配置），加入10 ml甲醇，加入TBS緩沖溶液至50 ml，加入30 ul 30% H₂O₂。

⑽ 染色液：1g氨基黑18B （0.1%），250ml異丙醇（25%）及100ml乙酸（10%）用蒸餾水定容至1L。

⑾ 脫色液：將350ml異丙醇（35%）和20 ml乙酸（2%）用蒸餾水定容至1L。