上海琛藝實業(yè)有限公司經(jīng)過數(shù)年的努力發(fā)展已迅速成為集產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營為一體的專業(yè)化生物工程公司。公司新引進細胞上千株，其中人的已通過STR鑒定的有幾百株，歡迎各位選購。。。。。。

產(chǎn)品名稱：HCCLM3-LUC人肝癌細胞-熒光素酶標記 培養(yǎng)方法

特點：細胞代數(shù)為4代以內(nèi)，細胞耐藥倍數(shù)8倍以上；

包裝：內(nèi)層無菌自封袋；防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋；說明書

細胞來源：ATCC、sciencell、ICLC

貨期：1-2周

運輸方式：快遞運輸

售后：收到細胞后12天，如發(fā)現(xiàn)細胞有質(zhì)量問題（如污染，死亡，快遞運輸?shù)仍颍r，應(yīng)出具書面質(zhì)量問題報告并及時通知銷售人員，我們將盡快為您解決！

注：耐藥細胞培養(yǎng)操作流程和普通細胞培養(yǎng)方法基本一致，只是在培養(yǎng)中會加藥維持篩選壓力

?BRL 3A細胞|BRL 3A大鼠肝細胞

1.質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時后換培養(yǎng)液。

8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

二、懸浮細胞

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，然后置于無菌操作臺，打開瓶口，輕輕吹打后，將其中的細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，然后1200rpm離心3min，去上清；

2.將離心好的細胞轉(zhuǎn)移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基，然后將其置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況及培養(yǎng)基顏色變化對其進行換液（離心后去舊液，加入新鮮培養(yǎng)基）；

3.顯微鏡觀察細胞數(shù)目比較多時，對其進行傳代，第yi次傳代比例為1:2（離心后平均分成兩瓶培養(yǎng)）。

細胞總數(shù)： 1~3*106

傳代周期： 2-3天

傳代比例： 1:2~1:4

換液頻率： 2-3天

凍存液： 90%FBS+10%DMSO

HCCLM3-LUC人肝癌細胞-熒光素酶標記 培養(yǎng)方法

四、注意事項：

1 收到細胞后首先觀察T-25瓶是否有損壞、漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2 瓶中運輸?shù)呐囵B(yǎng)液不能重復(fù)使用，請換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)

3 對于貼壁細胞，若大部分細胞漂浮，置于培養(yǎng)箱隔夜觀察，大部分漂浮細胞重新貼壁，表明細胞活力正常，繼續(xù)培養(yǎng)，剩余漂浮的細胞可以去掉；若大部分細胞仍然不貼壁，將漂浮的細胞離心收集，用臺盼藍染色鑒定細胞活力，并與本公司銷售人員及時聯(lián)系。

4 建議客戶收到細胞后不同倍鏡各拍幾張細胞的照片，記錄細胞狀態(tài)，如細胞狀態(tài)出現(xiàn)問題請于72h內(nèi)與本公司銷售聯(lián)系，以便于更好的幫您解決問題，超過時間我段，本公司則默認細胞狀態(tài)良好，不免費對后續(xù)細胞狀態(tài)問題進行售后。

做細胞實驗的同學(xué)看過來。

選擇上海琛藝生物細胞有3個理由：

1、細胞狀態(tài)好，形態(tài)佳，易成活，是市面上比較好養(yǎng)的細胞之一;

2、物流迅速，復(fù)蘇好后發(fā)貨，次日就能到;

3、使用我司推薦的進口品牌血清進行培養(yǎng)實驗，效果更佳。

專業(yè)技術(shù)人員萬工收藏的細胞培養(yǎng)小技巧:

1. 買細胞要去靠譜的地方買，比如 ATCC 或者上海琛藝。一般上面會有針對細胞的介紹，這樣培養(yǎng)之前可以了解細胞正常生長的狀態(tài)圖、傳代、培養(yǎng)基的類型等。

2. 不管是買的細胞，還是別人惠贈的細胞，剛拿到手趕緊的做兩件事：檢測是否有支原體污染;迅速擴增凍存，凍存細胞復(fù)蘇后第二天*更換一次培養(yǎng)基。

3. 發(fā)現(xiàn)細胞有污染迅速處理掉，特別是當你養(yǎng)了很多種細胞時。細菌污染、真菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，支原體污染的話，細胞會長的慢，可以買個支原體檢測的試劑盒定期檢測一下。

4. 不同細胞生長周期不同。有的生長很快，比如說 MDA-MB-231，傳代的時候取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了。有的又是特別慢，比如 BT474，傳代是一分二，復(fù)蘇起始的時候兩周多才能長滿。這就需要要在培養(yǎng)細胞的過程中多多摸索。

5. 對于嬌弱的細胞，就得細心呵護。胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉(zhuǎn)速和時間。每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。記住，是每天。

上海琛藝實業(yè)耐藥細胞株提供STR鑒定，上百株細胞等待您的選購，歡迎咨詢銷售陳靜。