中文名稱：hct116/L-GFP人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株-綠色標記 培養步驟
規格：T25
形態特征：
生長狀態：成纖維細胞樣
特征特性：貼壁生長
培養條件：DMEM(高糖）+10%FBS（推薦HAKATA優等胎牛血清貨號：HN-FBS-500）
傳代方法：消化3-5分鐘。1:2。3天內可長滿。
凍存條件無血清凍存液規格：100ML
支原體檢測：陰性
使用權限：A類
參考文獻：
供應商：上海琛藝實業有限公司
復蘇周期：10個工作日左右
hct116/L-GFP人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株-綠色標記 培養步驟

· 細胞名稱  ：

· 組織  小鼠乳腺癌細胞系

· 母細胞來源  客戶

· 轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選 

1. 質粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉化：感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。

6.小抽質粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染Gluc或Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中，室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內，37 ℃、5 % CO2條件下培養，8小時后換培養液。

培養步驟：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL*培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
 
1、對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的*培養基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。
4. 按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。
PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內，嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養瓶或6cm培養皿，加入5ml左右*培養基混勻，放入培養箱過夜培養后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續培養，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。
2、對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
 
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
 
操作步驟：
請收到細胞后，在倒置鏡下(是在4X物鏡)觀察整個細胞生長情況。
（一）如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內，嚴格無菌操作，打開細胞培養瓶，吸出培養液，換 10ml新鮮培養液后繼續培養。
（二） (二)如果細胞已長滿，即可進行傳代培養。具體步驟如下：
1.棄去培養液，用PBS（不含鈣,鎂離子）洗1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，倒放于37℃培養箱1-3分鐘預熱，之后翻轉培養瓶10-30秒后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量*培養基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加*培養基，輕輕打勻后吸出一半，分到新的培養瓶中。
如果沒有特別說明，收到細胞后的*次傳代一般是一傳二。

其他細胞如下：

293-LUC（HEK293-LUC)人胚腎細胞-熒光素酶標記

293-GFP(HEK293-GFP)人胚腎細胞-綠色標記

A549-LUC肺腺癌-熒光素酶標記

Bel-7402-GFP人肝癌細胞-綠色標記

C918-GFP人眼脈絡黑色素瘤細胞-綠色標記

CT26.WT-LUC小鼠結腸癌細胞-熒光素酶標記

CT26.WT-GFP小鼠結腸癌細胞-綠色標記

hct116/L-LUC人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株-熒光素酶標記

hct116/L-GFP人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株-綠色標記

HCT-116-LUC低分化結腸腺癌-熒光素酶標記

HCT-116-GFP低分化結腸腺癌-綠色標記

Hep3B-GFP人肝癌-綠色標記

LLC-LUC小鼠肺癌細胞-熒光素酶標記

LLC-GFP小鼠肺癌細胞-綠色標記

SGC-7901-GFP人胃癌細胞-綠色標記

SMMC-7721-GFP人肝癌細胞-綠色標記

SW620-LUC人結腸癌細胞-熒光素酶標記

SW620-GFP人結腸癌細胞-綠色標記

ARPE19-GFP人視網膜上皮細胞-綠色標記
 
上海琛藝是一家專業從事細胞培養相關產品的公司，擁有獨立細胞房（可隨時約定參觀），供應胎牛血清，STR鑒定細胞，感受態細胞等，專業，專注，性價比高，是您Shou選之家。