手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
用葡聚糖（Dextran）和聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）二相不連續(xù)梯度分離純化動(dòng)植物樣品的細(xì)胞膜片斷（特別是質(zhì)膜）的方法始于1989年（文獻(xiàn)1）。這種方法的特點(diǎn)是快速，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。只需要低速離心機(jī)（4,000rpm），分離成本低。
用PEG和Dextran 混合后再加入樣品，低速離心后形成上下二個(gè)液體相，體積相近。上液體相中對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的亞細(xì)胞構(gòu)造的排列，順序是（自下而上），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線(xiàn)粒體<溶酶體<高爾基體<質(zhì)膜；對(duì)于植物細(xì)胞其排列順序（自下而上）是：破碎的類(lèi)囊體<完整的葉綠體<糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線(xiàn)粒體，過(guò)氧化酶體<液泡膜<滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<類(lèi)囊體<高爾基體<溶酶體<質(zhì)膜。
常用的方法是：組織勻漿先以低速離心（甩平轉(zhuǎn)頭，500g，3min）去除沒(méi)有破碎的整細(xì)胞及其他組織碎片。上清液與Dextran 及PEG 混合后再低速離心（3,000xg，15min）形成二個(gè)液體相。
離心方案：
1. 原液制備：
Dextran （20％w/w）：220克 Dextran T-500 （Pharmacia 產(chǎn)品） 溶于780克純水，電磁攪拌器加熱（40℃）并攪拌至全部溶解。
PEG（3350，Union Carbide 公司出品，或相應(yīng)產(chǎn)品）300克溶于1升水。
2. 制備液體二相：取200克，20％ Dextran ，103克PEG原液，33ml 0.2M Na3PO4 （PH6.5）和179ml 純水在量筒中充分混合，靜置過(guò)夜形成二相液體，PEG在上，Dextran 在下。可以看到明顯的分界面，中間有較窄的隔離帶。分別取出二液態(tài)相備用（Dextran下相包含隔離帶）
3. 用合適的方法將含有107--108 個(gè)細(xì)胞的動(dòng)、植物組織制備成勻漿，用低速小型冷凍離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭（如Hitachi CF-RX 系列離心機(jī)，T5SS31 甩平轉(zhuǎn)頭或 CF-7D2 離心機(jī)T5SS 轉(zhuǎn)頭，zui大容量 4×250ml 單管容量從5ml 到 250ml，用戶(hù)可按實(shí)際情況選用不同容量的離心管。也可以用其他品牌離心機(jī)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）
4. 勻漿在500g （約1,600rpm）4℃離心3分鐘去除沒(méi)有裂解的細(xì)胞和組織（在沉淀中）
5. *次離心后的上清液在3,000xg （約4,100rpm）4℃ 離心15分鐘，保留沉淀。
6. 將第二次離心后的沉淀加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液（第2步前段），充分混合。2,000xg（約3,300rpm）, 4℃離心10分鐘。離心后仍保持4℃。等待形成明顯的二個(gè)液態(tài)相（有隔離帶），亞細(xì)胞構(gòu)造分布于二個(gè)液態(tài)相之中。
7. 分別收集（6） 離心后形成的二個(gè)含有亞細(xì)胞構(gòu)造的液態(tài)相備用（上相和下相，下相包含隔離帶）
8. 根據(jù)容量選擇合適的離心管（常用50ml 帶蓋圓底管），*類(lèi)離心管下部是（2）中形成的Dextean液態(tài)相和隔離帶；上部是（7）中用水稀釋?zhuān)?—5倍）的上相。上、下部體積比為6:4。
9. 第二類(lèi)離心管下部是（7）中離心后的下相（包含隔離帶），上部是（2）中制備的PEG液態(tài)相，上、下部液體的比例為4:6
10. 以上二類(lèi)離心管，分別用上下顛倒30—40次的方法充分混合后分別離心（3,000xg，約4,100rpm，4℃，10分鐘）
11. *類(lèi)離心管離心后上部液態(tài)相中主要含質(zhì)膜片斷，下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造
12. 第二類(lèi)離心管離心后上部及隔離帶中主要含質(zhì)膜片斷，下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造
討論：
1. 不同的組織，分離質(zhì)膜的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間及PH值各有差異，可以從實(shí)驗(yàn)中摸索，優(yōu)化。
2. 離心后其他亞細(xì)胞構(gòu)造可以用文獻(xiàn)中介紹的其他方法進(jìn)一步分離純化（例如用Percoll，Nycodenz，metrizamide作自形成梯度分離）
參考文獻(xiàn)：
1. Fisher. D. and Sutherland, I.A. “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989
2. W . Howard Evans “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood，Oxford Univ. press 1992
3. Presson A. 等 Biochem . J . vol:273 P173 （1991）
注：本文主要內(nèi)容摘自文獻(xiàn)（2）
上資料由www.xiangzhilxj.com 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司轉(zhuǎn)載提供，供您學(xué)習(xí)參考！長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司是專(zhuān)業(yè)生產(chǎn)制造離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)室儀器的高科技企業(yè)。公司擁有一批經(jīng)驗(yàn)豐富的工程技術(shù)人員，專(zhuān)業(yè)從事實(shí)驗(yàn)室儀器的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。公司生產(chǎn)、技術(shù)骨干均是多年從事實(shí)驗(yàn)儀器的精英。公司生產(chǎn)高速冷凍離心機(jī);冷凍離心機(jī);大容量離心機(jī);高速離心機(jī);低速離心機(jī)產(chǎn)品品種齊全，全系列離心機(jī)實(shí)現(xiàn)無(wú)刷化，技術(shù)先進(jìn)、性能穩(wěn)定、質(zhì)量可靠。歡迎垂詢(xún)!地 址：湖南省長(zhǎng)沙市望城坡 ： 410205
電 話(huà)：：李 1391780350網(wǎng) 址：www.xiangzhilxj.com 離心機(jī)網(wǎng)
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類(lèi)作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購(gòu)中心