鏈霉素（SM）檢測試劑盒

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜等樣本中的鏈霉素（Streptomycin，SM），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的鏈霉素和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗鏈霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鏈霉素含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中鏈霉素的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組織………………………………4ppb

蜂蜜………………………………2ppb

牛奶、奶粉………………………5ppb

2.4 交叉反應率：

鏈霉素……………………………100%

雙氫鏈霉素………………………100%

卡拉霉素…………………………6.3%

慶大霉素…………………………2.5%

 2.5 樣本回收率：

組織、蜂蜜、牛奶………………85±15%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準品：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標準品（紅蓋）：1ppm…………1ml

酶標記物（紅蓋）…………………11ml

抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

5X復溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：NaOH、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、正己烷、二氯甲烷、乙腈、磷酸

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.05M  PB緩沖液

    稱取12.9g Na₂HPO₄·12H₂O和2.175g NaH₂PO₄·2H₂O加去離子水1000ml溶解。

配液2：0.04M磷酸（蜂蜜樣品）

    1ml濃磷酸加去離子水定溶至360ml。

配液3：1M NaOH（蜂蜜樣品）

    稱取4g NaOH加去離子水定溶至100ml。

配液4：復溶液

    將5×復溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復溶，復溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織樣本

1）稱取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣品，加入8ml 0.05M PB緩沖液，振蕩5min，置56℃水浴環(huán)境放置30min；

2）室溫4000r/min以上離心10min；

3）取1ml上清液加入1ml正己烷，充分混勻，室溫4000r/min以上離心5min；

4）去除上層有機相，取50ul下層液，加入450ul 稀釋后的復溶液，混合30s；

5）取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：40     檢測下限：4ppb

5.3.2 蜂蜜、蜂王漿

1）稱取2±0.05g 樣品，加入4ml 0.04M磷酸，振蕩至*溶解，室溫4000r/min以上離心5min，直至清亮。（蜂蜜樣品可不用離心直接進行第2步）；

2）加入450ul 1M NaOH將PH值調(diào)至7-9之間(蜂王漿樣品需將全部上清移至另一干凈離心管中調(diào)節(jié)PH值至7-9之間)，室溫4000r/min以上離心5min ，直至清亮；

3）取50ul上清液，加入450ul稀釋后的復溶液混勻，混合30s；

4）取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：20     檢測下限：2ppb

5.3.3 牛奶、奶粉

1）稱取2±0.05g樣品，加入8ml 0.05M PB緩沖液，振蕩5min，置56℃水浴環(huán)境放置30min；

2）室溫4000r/min以上離心10min；

3）去除上層脂肪，取50ul中層澄清液體，加入450ul 稀釋后的復溶液，混合30s；

5）取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：50     檢測下限：5ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第1個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。