1）引物設計錯誤。

1）設計原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(根據實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物。

2）判斷方法：可用翊圣無縫克隆引物設計軟件核對，鏈接：h、t、t、p :122.112.245.84:8080/hieff-clone/

2）載體與目的片段使用比例失調。

1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。

2）載體與目的片段添加比例：

①單片段建議：適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

②多片段建議：適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。

3）載體與目的片段不純。

1）推薦對線性化載體、PCR產物進行膠回收純化。

2）純化產物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應體系體積1/5。

4）操作問題或試劑盒失效。

建議做試劑盒附帶的陽性對照實驗。判斷方法：

1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。

2）若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進行陽性對照實驗，進一步確定問題。

1）感受態細胞效率低，＜10⁷ cfu/μg。

建議用轉化效率大于10⁷ cfu/μg的感受態細胞。

判斷方法：可轉化0.1ng質粒（如PUC19），觀察克隆數，若生長大于1000個菌斑，則轉化效率大于10⁷ cfu/μg。

2）抗生素種類錯誤。

建議將未線性化載體轉化涂板。

判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯誤或濃度過高。需檢查質粒圖譜確認抗性或確認適濃度。

1）載體線性化不*。

建議將已制備的線性化的載體轉化涂板。  

判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不*。建議優化酶切體系。

2）體系中混入了相同抗性的環狀質粒。

1）產生原因：

①以反向PCR方式進行載體線性化，殘留環狀質粒模板導致。

②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環狀質粒，殘留環狀 質粒模板導致。

2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環狀質粒混入。建議PCR擴增產物先用DpnI 消化模板后，再進行膠回收純化處理或直接進行膠回收純化處理，去除殘留的環狀模板質粒導致的假陽性。

1）PCR產物混有非特異擴增產物。

1）可能情況：PCR擴增目的基因時有非特異條帶出現，未進行膠回收純化。

2）解決方案：

①優化PCR體系，提高特異性；

②膠回收PCR產物；

③鑒定更多的克隆。

2）片段缺失。

1）可能情況：載體或片段有多個同源重復序列。

2）解決方案：借助網站或軟件進行序列比對（如NCBI， Vector NTI等）。

1）菌落PCR引物錯誤。

建議用載體的通用引物進行菌檢，或至少使用一條通用引物。

2）PCR體系或程序不合適。

1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴增都無產物。

2）解決方案：

①優化PCR體系、程序；

②提取質粒，以質粒做模板PCR驗證；

③換酶切法鑒定克隆。

3）連接失敗。

1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物，另一端目的引物擴增無條帶，但載體通用引物擴增有條帶，且大小符合空載。

2）可能原因：載體線性化不*。建議優化酶切體系。

重組載體上有多個相同的酶切位點。

1）換其他酶切位點進行酶切鑒定；

2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定。

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