干貨分享|熱啟動酶耐熱機制全面解析

常規(guī)PCR技術因能夠快速擴增任何已知的DNA///片段而被廣泛應用于分子生物學的各個領域。但常規(guī)型PCR技術容易出現引物二聚體或錯配引起的非特異性擴增等現象，造成實驗結果的不準確性。熱啟動型PCR能夠很好的解決上述問題，是常用的提高PCR特異性的方法。

熱啟動酶介紹

熱啟動酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱至變性溫度時修飾物失活，釋放酶活，從而使PCR反應得以正常進行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢。

化學法

DNA聚合酶的化學法修飾，一般采用化學小分子如酸酐等有機物與聚合酶上的側鏈氨基酸（賴氨酸）通過化學反應相互作用，使酶低溫時失去酶活，溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學鍵斷裂，酶活釋放，從而達到熱啟動效果。化學修飾可有效封閉酶的活性，操作簡單，但酶活性釋放速度較慢，依賴溫度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特異性產物，可在室溫下配置反應體系，且對PCR反應buffer要求較高。

圖1：化學法修飾熱啟動酶原理圖

配體法

配體法修飾，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義，核酸適配體一般指一類具有特異性識別功能的單鏈核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識別分子，作用的靶分子范圍廣泛，從無機金屬的小分子到生物領域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構象，從而在表觀功能上與抗體類似。對蛋白質或其他小分子物質具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過非共價鍵與DNA聚合酶結合，進而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應。一般核酸適配體的篩選所需周期較短，整個過程能夠依賴自動化，簡便快捷。

圖2：配體法修飾熱啟動酶原理圖

抗體法

抗體法熱啟動酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性，使其在低溫時處于無活性狀態(tài)，在加熱至變性溫度時抗體變性，解除封閉從而釋放活性，可以大大避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增。另一方面針對低豐度基因，封閉抗體在避免預變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結合的同時，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出，大大提升反應靈敏度和擴增效率。

圖3：抗體法修飾熱啟動酶原理圖

表1：熱啟動酶常見修飾方法優(yōu)劣勢比較

以上簡單介紹了熱啟動酶的常見類別和各種熱啟動方法的優(yōu)劣勢，其中化學修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時，聚合酶的活性就被釋放出來，特異性不好；而抗體法修飾熱啟動酶對應的封閉效果佳，酶活釋放速度快，從而大大降低PCR反應時間，是目前IVD市場上應用較多的一種熱啟動酶改造方法。

熱啟動酶應用

熱啟動酶在熱啟動PCR的應用方面較為廣泛，不僅有效防止非特異性PCR產物，而且在較難擴增的PCR反應如單拷貝基因的擴增、多重PCR和超長片段的擴增等應用尤為突出，大大改觀了傳統PCR技術的局限性。在病原微生物檢測、遺傳病診斷和法醫(yī)鑒定等各個領域等實際應用中頗為廣泛。在應對爆發(fā)的新guan疫情方面，熱啟動酶亦貢獻頗多。目前市面上應用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動酶。

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參考文獻

【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.

【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.

【3】Chou Q , Russell M , Birch D E , et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(7):1717-1723.

【4】劉峰濤,柴立輝,馬遠方.DNA聚合酶適配子6-10提高定量PCR的特異性[J].臨床檢驗雜志,2009,27(03):164-166.