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巴氏殺菌機的殺菌的原理是在一定溫度范圍內，溫度越低，細菌繁殖越慢；溫度越高，繁殖越快。但溫度太高，細菌就會死亡。不同的細菌有不同的適生長溫度和耐熱、耐冷能力。
當今使用的巴氏殺菌程序種類繁多。“低溫長時間”(LTLT)處理是一個間歇過程，如今只被小型乳品廠用來生產一些奶酪制品。“高溫短時間”(HTST)處理是一個“流動”過程，通常在板式熱交換器中進行，如今被廣泛應用于飲用牛奶的生產。通過該方式獲得的產品不是無菌的，即仍含有微生物，且在儲存和處理的過程中需要冷藏。“快速巴氏殺菌”主要應用于生產酸奶乳制品。上通用的巴氏高溫消毒法主要有兩種：
一種是將牛奶加熱到62~65℃，保持30分鐘。采用這一方法，可殺死牛奶中各種生長型致病菌，滅菌效率可達97.3%~99.9%，經消毒后殘留的只是部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽孢等，但這些細菌多數是乳酸菌，乳酸菌不但對人無害反而有益健康。巴氏消毒牛奶要在4℃左右的溫度下保存，且只能保存3~10天，多16天。
第二種方法將牛奶加熱到75~90℃，保溫15~16秒，其殺菌時間更短，工作效率更高。但殺菌的基本原則是，能將病原菌殺死即可，溫度太高反而會有較多的營養損失。
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