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Western blot所必須的內(nèi)參及標(biāo)簽抗體
——衡量WB成功的標(biāo)尺
何為內(nèi)參抗體、何為標(biāo)簽抗體？
一 內(nèi)參抗體
內(nèi)參即內(nèi)部參照（Internal Control），類似于熒光定量實驗的內(nèi)參基因，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由看家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在不同組織和細胞中的表達相對恒定，常用它作為檢測目的蛋白表達水平變化時來做參照物。
2內(nèi)參抗體的選擇：
（1） 樣本種屬來源
哺乳動物的組織或者細胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、NaK、Atpase等。
植物來源實驗樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。
根據(jù)來源樣本選擇不同的內(nèi)參，是WB實驗成功的關(guān)鍵。也可參照文獻報導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。
（2）目的蛋白分子量
選擇內(nèi)參抗體時，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KD以上。比如目的蛋白分子量為45 KD，此時不適宜選擇β-actin（43 KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。
（3）內(nèi)參蛋白的表達部位
圖1 不同部位內(nèi)參蛋白展示圖
二 標(biāo)簽抗體
標(biāo)簽抗體的組成一般分為蛋白標(biāo)簽和目的蛋白兩部分。標(biāo)簽抗體的合成主要是將蛋白標(biāo)簽是利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。標(biāo)簽抗體（Tag Antibody）可用于檢測和純化各種商品化表達載體上的標(biāo)簽序列，分析目的蛋白的表達含量及其功能。其原理是抗原—抗體反應(yīng)，這些標(biāo)簽抗體可以高度特異地結(jié)合對應(yīng)的標(biāo)簽融合蛋白。
標(biāo)簽抗體的選擇可遵循以下原則：
檢測蛋白A+His標(biāo)簽，選擇抗His抗體；檢測蛋白B+MBP標(biāo)簽，選擇抗MBP抗體；
標(biāo)簽抗體是開展基因蛋白表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因功能研究的常用工具。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，相繼開發(fā)得到具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽，常見的蛋白標(biāo)簽有His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP 等。
表1 不同標(biāo)簽功能介紹
融合標(biāo)簽 | 大小（KD） | 功能 | 是否切除 |
HIS | 0.84 | 有利純化，能純化可溶性/包涵體蛋白 | 小標(biāo)簽，不影響蛋白功能 |
GST | 26 | 增強可溶性，僅能純化可溶性蛋白 | 大標(biāo)簽，需切除 |
MBP | 44.4 | 增強可溶性，減弱毒性蛋白 | 大標(biāo)簽，需切除 |
NusA | 55 | 增強可溶性，減弱毒性蛋白 | 大標(biāo)簽，需切除 |
SUMO | 11.2 | 增強可溶性，減弱毒性蛋白 | 大標(biāo)簽，需切除 |
三 翊圣標(biāo)簽抗體與內(nèi)參抗體
標(biāo)簽抗體
貨號 | 名稱 | 分子量 | 應(yīng)用 | WB稀釋比例 | 價格（元） |
30503ES20 | Flag-Tag, Mouse mAb | 20μl? | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 248 |
Flag-Tag, Mouse mAb | 100μl | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 748 | |
Flag-Tag, Mouse mAb | 1ml | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 3287 | |
Flag-Tag, Mouse mAb | 5ml | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 13687 | |
30401ES50 | His-tag, Mouse mAb | 50µl | ELISA, IF, WB, IP? | 1:2000-1:20000 | 688 |
30601ES60 | Myc-tag, Mouse mAb | 100μl | ELISA, IF, IP, WB | 1:5000 | 748 |
30701ES60 | HA-Tag, Mouse mAb | 100μl | WB,?IP? | 1:10000 | 748 |
30901ES50 | GST-tag, Mouse mAb | 50μl | ELISA, WB, IP | 1:5000-50000 | 688 |
內(nèi)參抗體
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 應(yīng)用 | WB稀釋比 | 價格（元） |
30101ES50 | β-actin, Mouse mAb | 50 µl | ELISA, IF, WB, IHC, FC, IP | 1:5000-50000 | 688 |
30102ES60 | β-actin, Rabbit pAb | 100 ul | ELISA, IF, WB, IHC | 1:1000-10000 | 998 |
30201ES60 | GAPDH (Clone:1A6), Mouse mAb | 20 µl | ELISA, IF, WB, IHC | 1:10000 | 738 |
30202ES60 | GAPDH, Rabbit pAb | 100 ul | WB | 1:2000 | 588 |
30301ES60 | β-Tubulin, Mouse mAb | 100 µl | IF, WB, IHC ,IP | 1:1000 | 948 |
30302ES60 | β-Tubulin, Rabbit pAb | 100 µl | IF, IHC, IP | 1:5000-10000 | 748 |
30304ES60 | α-Tubulin, Rabbit pAb | 100 µl | WB, IF, IHC, IP | 1:5000-10000 | 948 |
其他常用內(nèi)參類型推薦
貨號 | 名稱 | 分子量 | 品牌 |
細胞核膜 | Lamin A/C | 65-75 KD | 代理品牌 |
Lamin B1 | 66-72 KD | 代理品牌 | |
細胞核 | YY1 | 65-70 KD | 代理品牌 |
TBP | 33-43 KD | 代理品牌 | |
Histone H3 | 15-17 KD | 代理品牌 | |
PCNA | 36 KD | 代理品牌 | |
胞漿或全細胞 | GAPDH | 36 KD | 代理品牌 |
β-actin | 42 KD | 代理品牌 | |
Vinculin | 117 KD | 代理品牌 | |
β-Tubulin | 50-55 KD | 代理品牌 | |
α-Tubulin | 50-55 KD | 代理品牌 | |
膜蛋白 | ATP1A1 | 97-110 KD | 代理品牌 |
線粒體 | COX412 | 17-20 KD | 代理品牌 |
COX411 | 17-20 KD | 代理品牌 | |
Porin | 31-37 KD | 代理品牌 | |
全血/血漿/血清 | Albumin | 66 KD | 代理品牌 |
四 標(biāo)簽抗體標(biāo)記的蛋白純化產(chǎn)品
1 Anti-Flag親和純化凝膠
Anti-Flag親和純化凝膠由高質(zhì)量的鼠源 IgG2b單克隆抗體與Sepharose 4B gel 通過供價偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有較高的Flag標(biāo)簽融合蛋白加載容量（至少為1.1mg protein/ml gel），雜蛋白非特異結(jié)合少，可用于蛋白質(zhì)免疫沉淀（IP）和蛋白質(zhì)純化。
Anti-Flag親和純化凝膠可結(jié)合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag 融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag 融合蛋白（Protein-FLAG）。
圖2 Anti-Flag親和純化凝膠IP后蛋白電泳圖
1, 國外品牌 2,Yeasen；抗體濃度：7.5mg抗體/ml凝膠；蛋白結(jié)合量：1.25mg蛋白/mL凝膠；蛋白純度：＞95%
圖3 不同品牌Flag凝膠價格比對圖
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
20585ES03 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 1ml | 1487 |
20585ES08 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 5ml | 4797 |
20585ES25 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 25ml | 20987 |
20585ES60 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 100ml | 76187 |
2 瓊脂糖凝膠偶聯(lián)標(biāo)簽抗體
瓊脂糖凝膠偶聯(lián)標(biāo)簽抗體由高質(zhì)量的鼠源單克隆抗體與Sepharose 4B gel 通過供價偶聯(lián)制備，具有較高的標(biāo)簽融合蛋白加載容量，雜蛋白非特異結(jié)合少，可用于蛋白質(zhì)免疫共沉淀和少量蛋白質(zhì)純化。
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格（元） |
20586ES03/20586ES08 | Anti-HA Affinity Gel?（Anit-HA親和純化凝膠） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20586ES25/20586ES60 | Anti-HA Affinity Gel?（Anit-HA親和純化凝膠） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20587ES03/20587ES08 | Anti-Myc Affinity Gel?（Anti-Myc標(biāo)簽親和純化凝膠） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20587ES25/20587ES60 | Anti-Myc Affinity Gel?（Anti-Myc標(biāo)簽親和純化凝膠） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20588ES03/20588ES08 | Anti-V5 Affinity Gel?（Anti-V5標(biāo)簽親和純化凝膠） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20588ES25/20588ES60 | Anti-V5 Affinity Gel?（Anti-V5標(biāo)簽親和純化凝膠） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20589ES03/20589ES08 | Anti-His Affinity Gel?（Anti-His標(biāo)簽親和純化凝膠） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20589ES25/20589ES60 | Anti-His Affinity Gel?（Anti-His標(biāo)簽親和純化凝膠） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
3 標(biāo)簽多肽
蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。Yeasen公司推出的標(biāo)簽多肽可用于與帶有相應(yīng)標(biāo)簽的蛋白競爭性結(jié)合anti-標(biāo)簽單抗，以達到純化標(biāo)簽融合蛋白的目的。
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格（元） |
20571ES11/20571ES25 | 3X Flag-tag Peptide?（3X Flag-tag重復(fù)多肽） | 4mg/25mg | 2157/9537 |
20572ES11/20572ES25 | Flag-tag Peptide?（Flag-tag多肽） | 4mg/25mg | 1237/5587 |
20573ES08/20573ES25 | c-Myc Tag Peptide（c-Myc Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20574ES08/20574ES25 | HA Tag Peptide（HA Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20575ES08/20575ES25 | V5 Tag Peptide（V5 Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20576ES08/20576ES25 | 6X His Tag Peptide（6X His Tag多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20577ES08/20577ES25 | S-Tag (Pancreatic RNase A derivtive) Peptide（S-Tag?多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20578ES08/20578ES25 | T7 Tag Peptide（T7 Tag多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20579ES08/20579ES25 | VSV-G Tag Peptide（VSV-G Tag多肽） | 5mg/25mg | 2157/9537 |
20580ES08/20580ES25 | X-press Tag Peptide（X-press Tag多肽） | 5mg/25mg | 2157/9537 |
HB200525
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