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使用立式高壓滅菌器前，需要將腔體雜物清理干凈，使用前一定要仔細參考高壓滅菌器說明書，若有專人管理，建議用戶打印一份操作流程。
可以根據具體的滅菌物品設定溫度和時間，具體操作如下：
按“設定”鍵，此時顯示為溫度設定，可以按上下箭頭鍵，即可設置自己想要的數值，用同樣的方法可設定滅菌時間。
將滅菌器放置于平穩安全處，把手動排水閥擰至關閉處，向滅菌器內加入蒸餾水，加水時要緩慢些，以免加入過多的水從而影響儀器正常工作，直至高水位燈亮時，再多加入1-2升即可。
立式高壓滅菌器對于不同滅菌物品的滅菌操作要求如下：
將滅菌物品放入腔體擺放整齊，值得注意的是，物品擺放的高度要低于腔體，以免堵塞頂部排氣閥門，造成危險。不同的滅菌物滅菌的方法和時間都有區別，特別要注意的是敷料的滅菌，敷料是裝在不銹鋼器皿中的，多數用戶都忘記打開敷料盒的通氣小孔，以致于每次滅菌達不到試紙條的顏色，造成滅菌失敗。一些器具的滅菌是用布帶扎好滅菌，滅菌完畢后，不要拆開包裝的布帶，否則會再次污染。
對液體和培養基滅菌時，注意當滅菌完畢后，一定要讓儀器自然排氣冷卻，萬不可快速放氣，急劇冷卻，以免造成玻璃容器因溫度驟變而引起爆裂，從而威脅實驗人員的安全和造成污染。
在滅菌物品上建議蓋上一層布，這樣滅菌后的物品不會因潮濕而擔心滅菌效果，盡量讓高壓滅菌器自然冷卻，禁止打開上方的安全閥和排氣閥，以免造成高壓氣體傷人的危險。建議一個月打開一次儀器上方的安全閥和排氣閥，以免造成銹蝕直致銹死而帶來危險。
旋緊門蓋，將高壓滅菌器下方的手動排氣閥擰至排氣的適當位置，以方便腔體氣體均勻溫度，此時連鎖開關閉合，連鎖燈亮起，儀器開始工作。
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