Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒說明書

Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit

目錄號：K0199   

保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃

   其它組分：2                   - 8  度    

組分說明

Catalog no.               K0199B

Kit Size                 50 次

Nc-試劑   A               50 ml

Nc-試劑    B              3 ml

Nc-試劑   C              25 ml

蛋白酶抑制劑混合物            750 μl

產品簡介

  Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒能夠簡單、快速的提取來源于哺乳動物細胞及組織的細胞核和細胞漿蛋白，所提取蛋白保持生物學活性。本試劑盒首先通過細胞漿蛋白抽提試劑裂解細胞膜，釋放細胞漿蛋白，然后通過離心得到細胞核沉淀。后通過細胞核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白。抽提獲得的核蛋白及漿蛋白純度高，有效避免核/漿蛋白的交叉污染，可以用于Western、Gel Shift、報告基因檢測以及酶活力測定等后續操作。

注意事項

1. 如需提取磷酸化蛋白請在抽提試劑中加入磷酸酶抑制劑。

2. 所有樣品操作請置于冰上進行。

3. 可根據具體實驗情況調整試劑用量，保證各試劑使用比例為                               Nc-試劑   A：Nc-試劑     B：Nc-試劑     C=100：5.5：50。

4. 可以采用更高的速度來離心。

5. 戴手套操作。                                                                                                                                                           

操作步驟        

l    細胞中胞漿、胞核蛋白的提取

 1.  收集細胞，計數。

 2.  請在蛋白抽提前取出抽提試劑Nc-試劑A和Nc-試劑C進行預冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μ抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進行蛋白抽提前2-3分鐘內加入蛋白酶抑制劑混合物。

 3.  1×107細胞中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                   渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育20分鐘。

    注意：各種細胞的特性不同，需要根據不同細胞的特性調整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續Nc-試劑B、Nc-試劑C的用量。

 4.  加入55    μl Nc-試劑    B，渦旋5秒以充分混勻，冰上孵育1分鐘。

 5.  4℃  12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞漿蛋白）。

 6.  向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                      渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。

 7.  4℃  12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞核蛋白）。 組織中胞漿、胞核蛋白的提取

 1. 取材，保存組織。

 2. 請在蛋白抽提前取出抽提試劑Nc-試劑A和Nc-試劑C進行預冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

     注意：在進行蛋白抽提前2-3分鐘內加入蛋白酶抑制劑混合物。

 3. 稱組織重量，每100 mg組織中加入1 ml Nc-試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），用勻漿器在冰上充分勻漿，

    放置在冰上孵育20分鐘。

    注意：各種組織的特性不同，需要根據不同組織調整Nc-試劑A的用量，如果蛋白濃度小，按比例減少Nc-試劑A及后續Nc-試劑B、Nc-試劑C

的用量。

 4. 加入55μl Nc-試劑B，渦旋5秒以充分混勻，放置在冰上孵育                        1分鐘。

 5.  4℃12,000 rpm（13,400×g）離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞漿蛋白）。

 6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-試劑C（使用前加入蛋白酶抑制劑混合物），                      渦旋5秒以充分混勻，重懸沉淀，冰上孵育40分鐘，每隔10分鐘渦旋混勻一次，每次約15-30秒。

 7.  4℃12,000 rpm離心15分鐘，收集上清（盡量收集干凈上清液）至另一離心管中，-20℃保存待測（此提取液為胞核蛋白）。

參考附表                            

                                              表1.  常見問題及解決辦法

問題                   可能原因            解決方法

                  細胞未裂解                   適量增加試劑的使用量

1細胞漿/核蛋白提取率低

                   細胞沉淀未充分懸浮                充分渦旋

                     未*收集細胞核           延長加入Nc-試劑 B 后的離心時間

2蛋白濃度低         未加入足量抽提試劑               調整試劑使用量

3蛋白無活性或     樣本未置于4℃環境中  請于4℃離心，除渦旋外，保證樣品置于冰上

活性過低            蛋白酶不*抑制        添加其它蛋白酶抑制劑

            未*移走細胞漿蛋白裂解液裂解細胞核前，小心移走細胞漿蛋白裂解液

4細胞核及漿蛋白

   未分開        未充分裂解細胞  增加渦旋時間確保收集的細胞充分懸浮

                 組織勻漿過度、不足或不均勻             優化勻漿條件

實驗室代做實驗項目

試劑盒免費代檢測