PCR-Free建庫，你get到了嗎？

高通量測序中，常規的文庫構建需要PCR擴增，一方面，是為了對微量DNA樣本進行擴增，提高文庫產量，另一方面，可以放大熒光信號，讓測序儀更容易捕獲和識別熒光信號，提高測序準確度。但是，PCR就像一把“劍”，在解決了樣本起始量低的問題并起到放大熒光信號作用的同時，卻也引入了擴增錯誤和偏向性，不能地呈現基因組序列“真實面貌”。因此，PCR-Free技術的引入，既具備了PCR的優勢，也克服了PCR的缺點。

什么是PCR-Free技術？

常規NGS文庫構建的核心步驟為：基因組打斷-末端修復-加接頭-PCR-測序前信號放大。那么，PCR-Free建庫又是怎樣的呢？顧名思義，就是不需要PCR的建庫過程。其文庫構建的核心步驟為：基因組打斷-末端修飾-加接頭-文庫質控。但事實上，這只能算是建庫環節的PCR-Free。真正的PCR-Free，應該是從建庫到測序全流程均無文庫擴增的過程（例如單分子測序技術）或者無PCR擴增錯誤累積的測序技術（例如MGI的DNBseq）。

圖1：常規建庫與PCR-Free建庫流程圖

PCR-Free技術優勢

在常規建庫過程中，擴增酶存在引入錯誤的可能，通過循環擴增, 這些錯誤會被積累放大，降低了DNA序列復制的保真性。此外，DNA聚合酶還具有一定的擴增偏向性，尤其是針對GC含量差異大或者二級結構等區域，擴增效率低，覆蓋均一性差；在引入錯誤InDel的同時，還會帶來大量的Duplication，造成DNA數據量的浪費，增加測序成本。而PCR-Free技術則能很好地規避常規建庫中因PCR擴增而引入的上述問題，具體優勢如下圖所示。

圖2：PCR-Free技術優勢

PCR-Free數據展示

1.華大平臺Hieff NGS^® OnePot II DNA Library Prep Kit （Cat#13321）PCR-free建庫，相同投入量，不同的打斷時間，均能獲得良好的純化回收率和環化效率。具體數據如下表：

表1：MGI平臺PCR-Free建庫數據

2.Illumina平臺Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit（Cat#12204）與En*建庫試劑盒進行PCR-Free建庫實驗。上機測序數據結果顯示：12204測序數據更佳。

表2：Illumina平臺PCR-Free測序數據

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