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相差顯微鏡使用中的幾個問題：
（1）相位倒轉 當n’<n或n’>n時得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉。當相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當δ繼續增大到某一值后會出現相位倒轉。用90%高吸光值（高反差）物鏡時，這個轉變值約為0.55λ，用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應該用于分辨較小的光程差。
（2）暈輪和漸暗效應 在相差顯微鏡成象過程中，某一結構由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結果。因此在黑暗區域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細結構的觀察，當環狀光闌很窄時暈輪現象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現象是漸暗效應，指相差觀察相位延遲相同的較大區域時，該區域邊緣會出現反差下降。
（3）樣品厚度的影響 當進行相差觀察時，樣品的厚度應該為5μm或者更薄，當采用較厚的樣品時，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產生相位移干擾及光的散射干擾。
（4）蓋玻片和載玻片的影響樣品要蓋上蓋上蓋玻片，否則環狀光闌的亮環和相板的暗環很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質量也有較高的要求，當有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時會產生亮環歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環狀光闌亮環變大或變小。
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