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蛋白質免疫印跡雜交實驗（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻譯指導蛋白質合成量分析檢測手段中經典和廣泛為業界認可的一種,也是論文中常見的數據呈現形式之一。雖然Western Blot實驗原理比較簡單，但是實驗耗時長、步驟繁瑣和實驗結果重復性差，導致剛進實驗室的小伙伴們，實驗做的焦頭爛額。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot實驗結果呢，請小伙伴們跟隨星博士的腳步，了解Western Blot實驗的相關知識，let's go！
Western Blotting實驗步驟：
- 樣品制備
樣本制備是決定蛋白質免疫印跡是否成功的關鍵步驟之一。樣本必須進行研磨、勻漿、超聲處理。膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還需要注意的一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷為大家提供強、中、弱三種RIPA裂解液，以及適用于各種類型的蛋白酶抑制劑。
- 電泳分離
準備好樣品后，第二步就是上樣和電泳分離了，上樣之前小伙伴們要做的必要步驟是確定蛋白質濃度，根據蛋白質濃度確定上樣量。星博士給大家推薦BCA和Bradford兩款蛋白濃度測定試劑盒，小伙伴們可以根據自己的實驗需求自行選擇。
測完了蛋白質濃度，接下來就是上樣了。首先要制備凝膠，選用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（EC0003），簡單省時。然后安裝電泳槽，將膠片安置在電泳槽中，在電泳裝置中加入SDS-PAGE電泳液。思科捷提供10×的電泳液，稀釋后直接使用，方便快捷。
上樣結束后，設置電泳程序一般濃縮膠80V，分離膠120V，電泳時間一般為1-2小時，根據溴酚藍指示位置選擇停止電泳時間即可。
- 轉膜
針對特定分子量大小靶蛋白而選擇適當轉膜條件（轉膜時間，轉膜緩沖液和必要低溫環境）能夠將 SDS-PAGE 膠上蛋白樣品盡可能*轉移到印跡膜上，同時減少蛋白不必要的降解，這對于終獲得清晰、可信結果也是需要考慮因素。轉膜方式主要包括濕式電印跡法（轉膜方法）、半干式電印跡（可選的替代轉膜方法）以及干式電印跡（有限靈敏度的轉膜方法）。根據實驗室習慣和需求，小伙伴們可以自行選擇轉膜方式。
膜的選擇
膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因為可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白含量不確定，從而影響終結果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。常見的膜有NC膜和PVDF膜，區別如下：
NC膜 | PVDF膜 | |
靈敏度和分辨率 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 較高 |
結合能力 | 80-110ug/cm2 | 125-200ug/cm2 |
材料質地 | 干的NC膜易脆 | 機械強度高 |
溶劑耐受性 | 無 | 有 |
操作程序 | 緩沖液潤濕，避免氣泡 | 使用* %甲醇潤濕 |
檢測方式 | ECL檢測 | ECL檢測 |
價格 | 較便宜 | 較貴 |
轉膜方式的選擇
濕轉：
通常我們在做濕轉的時候，選擇100V恒壓（高強度，因為低強度時間較長，且效率較低），電流控制在120-350mA之間，分子量在60KD以下的60分鐘即可，分子量在60KD以上的需要延長轉膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉膜。所以如果你所研究的兩個蛋白分子量差異比較大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考慮將膠從中間分開，兩部分分別采用不同時間轉印，能達到你理想的效果。電轉液一般可以重復使用3次，之后電流會過大，不適合再使用。
濕轉 | |
優點 | 缺點 |
轉膜條件靈活容易進行調整 | Buffer加熱可能干擾轉印 |
多種Buffer可用于優化轉印 | 在轉印的時候需要制冷裝置 |
可以延長轉印時間 | 需要大量的轉膜緩沖液 |
可用于定量Western Blot | |
半干轉：
對于半干轉來說，也需要進行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉印buffer中進行預平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強的電流通過三明治結構，轉印速度較快，一般小于1h。
半干轉 | |
優點 | 缺點 |
轉膜速度快 | 低分子量蛋白容易轉過 |
用不連續的Buffer系統優化轉印的蛋白 | 對于分子量＞120KDa的蛋白，轉印較困難 |
轉膜緩沖液用量少 | 轉膜過程容易干膠 |
容易安裝 | 對于定量的Western實驗不推薦使用 |
對于同一蛋白的多張膜的分析比較有益 | |
需要注意的是：低溫對于膜的轉印是至關重要的，尤其是在轉印時間較長而無人監管的情況下。針對剛建的實驗室平臺或者一些新蛋白的研究，經過轉印的膠和膜都要通過染色確定轉膜效率（膠用考馬斯亮藍加熱染色，膜用麗春紅染色，均只需幾分鐘，并不耽誤太多時間），不然后面的實驗既費時也費抗體。
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