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多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。
化學合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時應將不需要反應的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應，這樣保證了多肽合成目標產物的定向性。多肽的化學合成又分為液相合成和固相合成。
多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發展迅速，在多肽和蛋白質合成領域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據多肽片段的化學特定性或化學選擇性，多肽片段能夠自發進行連接，得到目標多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。
多肽的生物合成方法主要包括發酵法、酶解法，隨著生物工程技術的發展，以DNA重組技術為主導的基因工程法也被應用于多肽的合成。
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