測量外泌體的粒徑分布直以來都是外泌體表征的重要組成部分。但是由于外泌體的尺寸僅為30~200 nm，所以必須借助些殊的檢測手段才能夠對這種在光學顯微鏡下不可視的顆粒進行觀測。本篇就外泌體粒徑測量技術的發展進行簡述，并對不同技術的差異進行比較。

、電鏡技術

在外泌體發現的早期，由于還沒有門針對這類尺寸顆粒的分析方法，因此直接在電鏡下面觀察粒徑并統計成為了早的外泌體粒徑統計方法。但是這種方法費時費力，且通量低，在面對臨床和科研中的大量樣本時顯得十分無力。

文獻中外泌體在電鏡TEM模式下的經典形態

二、動態光散射技術 & 納米粒子跟蹤分析技術

由于外泌體與材料學所合成的脂質體在形態上十分相似，因此用于脂質體表征的動態光散射技術（DLS）便被應用于外泌體的尺寸測量上。DLS用光射到遠小于其波長的小顆粒上時會產生瑞散射現象，通過觀察散射光的強度隨時間的變化推算出溶液中顆粒的大小。但是這種技術會受到測量物質的顏色、電性、磁性等理化性的影響，并且對于灰塵和雜質十分敏感。因此使得DLS在測量尺寸較小的粒子時，測量出的粒徑與實際的分布具有較大的偏差。

為了彌補DLS的短板，納米粒子跟蹤分析（NTA）技術孕育而生。這種技術采用激光散射顯微成像技術，用于記錄納米粒子在溶液中的布朗運動軌跡，并通過Stokes-Einstein方程推算粒子大小。這種技術能夠對30~1000 nm的粒徑進行測量，因此能夠提供更為精確地粒徑數據。在諸多文獻的測試中均取得了較DLS更好的精度，因此成為目前為主流的外泌體尺寸測量手段。

NTA技術的工作原理與DLS技術在測量不同尺寸納米球的數據對比。可見相比于DLS，NTA測量的粒徑分布更為精確。

雖然NTA取得了比DLS 更高的精準性，但是隨著外泌體研究的深入，其局限性也十分明顯。NTA僅能夠測量溶液中顆粒的平均粒徑尺寸，但是NTA無法分辨其中的外泌體、囊泡、脂蛋白，也不能區別不同源性的外泌體。這直接限制了外泌體粒徑表征的意義，使得研究者很難探究外泌體尺寸與外泌體來源之間的關系。另外NTA本身對于測試時的溫度、濃度和校準都有著較高要求，因此使得NTA在測試較小的粒子時其精度仍不能達到令人滿意的效果，其測試結果卻仍與電鏡、AFM等成像技術所觀測到的粒徑存在著明顯差異。
 

外泌體在TEM下的成像及粒徑統計與NTA測量的結果對比。可見NTA測量到的粒徑要比TEM直接測量的結果大50~100 nm。

三、單粒子干涉反射成像技術

為了解決上述在實際測試中的問題，種新型的單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術孕育而生。這種技術摒棄了布朗運動軌跡追蹤方法，通過基底與顆粒形成的相干光進行成像，通過成像后的亮度來直接計算納米粒子的大小。從而避免了NTA測量粒徑軌跡誤差大的短板，擁有更高的靈敏度和精度，即使對于NTA無法區分的40 nm與70 nm的粒子混合溶液也依然能夠取得很好的分辨率。

SP-IRIS的原理及芯片微陣列打印的成像效果和對混合不同粒徑小球的區分效果。可見SP-IRIS技術擁有更高的測試通量和測量精度。

得益于這種高精度測量方法，越來越多的研究者終于能夠測量到與電鏡直接觀測相當的粒徑。這種勢所帶來的效果不單單是能夠讓TEM的數據與納米粒子表征的數據更為致，同時還能夠表征不同來源的外泌體之間的粒徑差異。

SP-IRIS、NTA和TEM統計同樣品時所測量的粒徑分布。SP-IRIS在測量不同尺寸的外泌體時，測量的粒徑與TEM的尺寸統計基本致，而NTA統計的粒徑則比TEM大約50 nm。此外SP-IRIS技術還能夠提供不同來源外泌體的尺寸差異，能夠看出CD9來源的外泌體要比其它來源的外泌體大~10 nm。

SP-IRIS的另個勢在于能夠更換激光源的波長，因此除了能夠實現外泌體的形貌成像外，還能夠實現單外泌體的熒光成像。使得單外泌體的熒光共定位成為可能，研究者通過這種單外泌體熒光成像能夠研究單外泌體的表型、載物、來源等生物信息。

使用SP-IRIS 對受傷組和對照組小鼠不同時間點的血清CD9、CD81來源外泌體的分泌量監測。可以看到CD81來源的外泌體的分泌量呈現增加后減少的趨勢，而CD9來源的外泌體分泌量則直在增加。

綜上所述，由于SP-IRIS技術的高精度、高靈敏度、可做單外泌體熒光成像的勢，目前有越來越多的學者開始對比NTA技術和SP-SPIS技術，其結果均認為SP-SPIS技術測試的效果要明顯于NTA，這其中也不乏Cell等高水平期刊。相信在不久的將來，SP-IRIS技術將會越來越普及，為研究者研究外泌體打開新的大門。

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