細胞轉染 的方法主要包括:電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、多種陽離子物質介導、病毒介導的轉染等,理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等。
一、脂質體(liposome)轉染 方法原理
脂質體(liposome)轉染 方法原理:脂質體((Iiposome)作為體內和體外輸送載體的工具,已經研究的十分廣泛,用合成的陽離子脂類包裹DNA,同樣可以通過融合而進人細胞。使用脂質體將DNA帶人不同類型的真核細胞,與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復性。
中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電 的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。
二、脂質體轉染操作步驟
1、操作步驟[方法一]:
(1)細胞培養:取6孔培養板(或用35mm培養皿),向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養液,37℃CO2培養至40%~60%匯合時(匯合過分,轉染后不利篩選細胞)。
(2) 轉染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現微濁現象,但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應酌情減量)。
(3)轉染準備:用2mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養液。
(4)轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。
(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。
注意:轉染時切勿加血清,血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]:
(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時,使其達到50~60%板底面積。
(2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下:
①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。
②旋轉1秒鐘,再加入脂質體懸液,旋轉。
③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結合在脂質體上。
(3)棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物,37℃培養3~5小時。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續培養14~24小時,
(5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養24~48小時。
(6)用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。
3、穩定的脂質體轉染方法如下:
(1)接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉染。
(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養48小時。
(4)吸出DMEM,用G418選擇培養液稀釋細胞,使細胞生長一定時間,篩選轉染克隆,方法參照細胞克隆篩選法進
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