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反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用*泛的技術，主要是因為它適用于分析絕大多數的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。
如果污染是因為重復進樣時強保留物質的累積引起的，利用簡單的清洗步驟來除去這些污染物往往就能恢復其色譜性能。經過等度運行后的高效液相色譜柱，有時用90～100%含量的溶劑B(雙溶劑反相系統中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等)沖洗20個柱體積可以清除污染物(色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml)。
如果使用的是緩沖鹽系統，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會導致更大的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖鹽流動相(即把緩沖液換成水)，沖洗5～10個柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
有時候，強溶劑B也沒法把殘留在高效液相色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。
如果污染物不是生物質的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問題。柱子生產廠家的網頁和產品說明書上很多也有清洗方法推薦。
所有的清洗方法的模式普遍都類似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個溶劑往往是非極性(疏水性)很強的(如醋酸乙酯甚至是烷烴)，以便于溶解脂質、油類等非極性污染物。溶劑系列中每個溶劑都保證能與下一個溶劑互溶。
整個清洗過程結束后，在回到原來的流動相體系前，必須借助一個中等強度的互溶性非常好的溶劑過渡。例如， 異丙醇是一個非常好的過渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。
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