細菌呼吸鏈復合物4活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

    細菌呼吸鏈復合物4活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過細胞色素C氧化酶反應系統中還原性細胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌裂解懸液呼吸鏈復合物IV的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

細菌呼吸鏈復合物IV （Bacterial Complex IV），又稱為細胞色素氧化酶（cytochrome oxidase；EC1.9.3.1）或細胞色素bc1 復合物（Cytochrome bc 1 complex），存在于細菌細胞膜上，為呼吸臉上的終端酶，屬于含血紅素/銅終端氧化酶超級家族成員之一，與真核細胞線粒體復合物IV的核心結構類似，含有I至III保留的核心亞體，細菌共有4個亞體，而線粒體共有13個亞體。在細菌有氧生長環境中，復合物IV為誘導性，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。基于底物還原型細胞色素C（reduced cytochrome c），受到呼吸鏈復合物IV的催化，轉化為氧化型細胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定呼吸鏈復合物IV的活性。呼吸鏈復合物IV反應系統為： 

產品內容

    緩沖液（Reagent A）         毫升

    反應液（Reagent B）         毫升

    稀釋液（Reagent C）           毫升

    穩定液A（Reagent D1）         管

    穩定液B（Reagent D2）         微升

產品說明書               1份

保存方式

    緩沖液（Reagent A）和    稀釋液（Reagent C）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；    反應液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應液配制的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的    穩定液B（Reagent D2）置入冰槽里融化，然后移出xx微升到    穩定液A（Reagent D1）管里，混勻后，標記為    穩定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的    反應液（Reagent B）置入冰槽里融化；然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升    穩定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標記為    反應工作液（注意：見注意事項4），放在暗室里。然后進行下列操作。

一、 測讀準備

1． 準備好含有復合物IV的樣品，置于冰槽里

2． 設定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設置0秒和60秒各測讀1次

3．     緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的1毫升比色皿

2． 加入xx微升    稀釋液（Reagent C）

3． 上下傾倒數次，混勻

4． 室溫下孵育3分鐘

5． 加入xx微升含有    反應液（Reagent B）和    穩定液（Reagent D）的    反應工作液

6． 上下傾倒數次，混勻

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數－60秒讀數），正常讀數差值為0.001至0.005

三、 樣品測定

1． 移取xx微升    緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升待測樣品（注意：建議總量50微克細菌蛋白）

3． 上下傾倒數次，混勻

4． 室溫下孵育3分鐘

5． 加入xx微升含有    反應液（Reagent B）和    穩定液（Reagent D）的    反應工作液

6． 即刻上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0秒讀數－60秒讀數），通常活性讀數差值為正數

四、 計算樣品活性

注意事項

1． 本產品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 線粒體樣品中忌用DTT和巰基乙醇等處理

4． 每增加1個樣品，增加    反應工作液為：    反應液（Reagent B）100微升＋    穩定工作液3微升，以此類推。配制反應工作液時，須根據樣本數量配制實際工作液容量

5． 系統操作過程中，背景測定只需1次

6． 分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產生信號

7． 加樣后3秒內進行比色測定

8． 比色測定后，比色皿須清洗*

9． 比色皿背景空對照0秒讀數通常大于0.2為理想狀態；建議使用比色皿測定

10． 背景空對照的正常讀數差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負即可）

11． 樣品0秒讀數通常和背景空對照0秒讀數一致

12． 樣本測定60秒讀數低于0秒讀數表明具有酶活性

13． 線粒體呼吸鏈復合物IV酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）氧化1微摩爾的細胞色素C

14． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供     Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 30030.1）

15． 本公司提供系列細菌復合物研究產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感