磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器

或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 α-KGDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或

200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 α-KGDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入 18mL 試劑四充分溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）

水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在試劑六中加入 1mL 蒸餾水，充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑六和 180μL 試劑五，混

勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

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