一、蛋白樣品制備

　　之前和大家介紹過細胞和組織蛋白質的提取，當我們做WB的時候，需要對提取好的蛋白樣品進行處理：在蛋白樣品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上樣緩沖液）稀釋至1X（如蛋白樣品有120ul，則加入SDS loading buffer 6X 600ul），混勻，75-95度加熱10-15分鐘，使蛋白變性以充分暴露抗原位點。在加熱結束后，進行離心，使蛋白樣品適當降溫，防止PAGE膠被融化。

　　PS：要測量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加熱到75度，一般情況可95度加熱。市面上買到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀釋至1X即可。

　　那么為什么我們加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在電泳中起了關鍵的作用。

　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚藍，作為指示劑，方便觀察電泳進行的程度；B：10%甘油，密度大，增加樣本的重量，可攜帶樣本沉到底部；C：2%SDS，是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，按一定比例和蛋白質分子結合成為復合物，是蛋白質帶滿負電荷，從而是蛋白帶電荷一致，減少電荷對電泳結果的影響；D：巰基乙醇還原劑，使蛋白質的二硫鍵斷開，使得蛋白保持線性結構。

　　二、蛋白上樣

　　1. 將之前配好的膠固定在電泳裝置上，加入1X電泳液

　　2. 拔出梳子，應該兩側同時用力，緩慢拔出，注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使其變形，若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正。

　　3.加入蛋白樣品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul  -40ul蛋白樣品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul  -30ul蛋白樣品，是用微量注射器加樣，平時我們也可以用普通的移液槍加樣，盡量讓槍頭深入梳孔底物，防止蛋白樣品飄出，一般在目的蛋白兩側加入等量的marker，如果兩側有空的梳孔，應該加入1X的loading buffer，起“壓邊”作用，可以使蛋白樣品在一條水平線上往下跑。

　　4.電泳：接上電極，正負極不要弄反，紅色對紅色，黑色對黑色，初始電壓設為90V，當樣品跑至分離膠時將電壓調至120V，一般在溴酚藍跑出膠時停止電泳，也可根據目的蛋白的分子量來選擇跑的時間，如分子量較大，可以延長電泳時間，使得分子量大的marker跑的分散開，容易判斷分子量。

　　三、注意事項

　　1.蛋白樣品上樣量最好相等，不要過多。

　　2.不要過多重復使用電泳Buffer

　　3.最佳分辨區在分離膠的2/3

　　4.電泳后測定的分子量有10%的誤差，不可*信任。有些蛋白質由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上的肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈，SDS-PAGE電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量，有的蛋白質（如電荷異常或結構異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質）不能采用該發測相對分子量。

　　5.如果電泳中出現拖尾，染色帶的背景不清晰等現象，可能是SDS不純引起。