冰凍切片氧化應(yīng)激活性氧次氯酸離子熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版） 

主要用途 

冰凍切片氧化應(yīng)激活性氧次氯酸離子熒光測(cè)定試劑盒是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑氨苯基熒 光素，與細(xì)胞內(nèi)次氯酸陰離子的反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光，來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)次氯酸活性氧族的生成和增加的* 而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適宜于冰凍動(dòng)物組織的次氯酸陰離子分析。 可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易， 活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。  

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2- ）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基 （hydroxyl radical；OH- ）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO- ）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷 氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO- ）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等 細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。次氯酸陰離子 與細(xì)胞膜成分反應(yīng)，氧化質(zhì)膜上氫硫基團(tuán)，通過(guò)胺和不飽和脂肪酸的氯離子化和破壞鐵硫中心，達(dá)到干擾 細(xì)胞功能，包括葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和鉀泵能力。氨苯基熒光素（Aminophenyl fluorescein；2-[6-(4’-Amino)  phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；APF）是一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜的熒光染色劑，選擇性與次 氯酸陰離子反應(yīng)，生成強(qiáng)烈熒光的熒光素（fluorescein），同時(shí)在羥苯基熒光素（Hydroxyphenyl fluorescein； 2-[6-(4’-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）的對(duì)比存在下，排除其它活性氧族的干 擾。據(jù)此證明組織細(xì)胞內(nèi)次氯酸活性氧族的存在。  產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升 染色液（Reagent B） 微升 本底液（Reagent C） 微升 稀釋液（Reagent D） 毫升 產(chǎn)品說(shuō)明書 1 份  

保存方式 

保存染色液（Reagent B）和本底液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照； 其余的保存在 4℃冰箱里，有效保證 6 月 

 用戶自備

1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器  培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育  （共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細(xì)胞 

1實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）和 本底液（Reagent  C）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent D）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 微升 染色液（Reagent B）到新的 1.5 毫升離心管，加入 微升稀釋液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記 為 染色工作液，置入暗室里；同時(shí)移出 微升本底液（Reagent C）到新的 1.5 毫升 離心管，加入 微升稀釋液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記為本底工作液，置入暗室 里。然后進(jìn)行下列操作。 1． 準(zhǔn)備 2 片同一切面厚為 10 微米的未經(jīng)固著處理的待測(cè)冰凍切片：標(biāo)記為樣本和本底 2． 置于室溫下，分別小心加上 微升預(yù)冷的 清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面 3． 分別小心移去切片上的 清理液（Reagent A） 4． 小心加上 微升室溫預(yù)熱的 染色工作液到樣本切片上，鋪滿整個(gè)切片表面 5． 小心加上 微升室溫預(yù)熱的 本底工作液到本底切片上，鋪滿整個(gè)切片表面 6． 在 37℃濕潤(rùn)培養(yǎng)箱里，孵育 30 分鐘，避免光照（注意：避免液體蒸發(fā)） 7． 分別小心移去切片上的 染色工作液和 本底工作液 8． 分別小心加上 微升 清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面 9． 分別小心移去切片上的 清理液（Reagent A） 10．放上蓋玻片或封片 11．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)波長(zhǎng) 499nm，散發(fā)波長(zhǎng) 515nm――（樣本綠色熒光—本底 綠色熒光）增強(qiáng)，表明次氯酸陰離子含量高 注意事項(xiàng) 1． 本產(chǎn)品為 20 次操作  2． 建議使用新鮮組織（手術(shù)切除后 1 小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片  3． 操作時(shí)，須戴手套  4． 染色工作液和 本底工作液，避免光照 5． 孵育時(shí)，須避免光照  6． 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光定性分析 7． 根據(jù)細(xì)胞類型，同步調(diào)整 染色工作液和本底工作液使用劑量（1：200 至 1：1000 容量比），避免過(guò)度染色 8． 如果次氯酸陰離子濃度過(guò)低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 60 分鐘 9． 激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇在 485 至 500nm，散發(fā)波長(zhǎng) 505 至 550nm 之間的任一波長(zhǎng) 10．本公司同時(shí)提供系列次氯酸活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰