冰凍切片過氧亞硝基陰離子活性氧（ONOO^-）熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

  冰凍切片過氧亞硝基陰離子活性氧（ONOO^-）熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氫羅丹明123，在組織細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生綠色熒光，來定量檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝基陰離子活性氧族的生成和增加的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。可以被用于一氧化氮代謝、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。適宜于冰凍動(dòng)物組織的分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，定性檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中過氧亞硝基陰離子是由亞硝酸和過氧化氫反應(yīng)或超氧陰離子與一氧化氮反應(yīng)所產(chǎn)生，成為強(qiáng)力氧化劑和硝酸化劑，進(jìn)而與細(xì)胞內(nèi)的硫氫基（sulphydrils）、金屬分子、二氧化碳、酪氨酸殘基等目標(biāo)分子反應(yīng)，引起細(xì)胞，包括DNA和蛋白大分子的損傷，導(dǎo)致各種炎癥、血管硬化和神經(jīng)退行性病變等。作為過氧亞硝基陰離子的特異性熒光探針二氫羅丹明123（dihydrorhodamine 123；DHR），是一種*自由通過細(xì)胞膜的染色劑。一旦受到過氧亞硝基陰離子的氧化，便釋放出產(chǎn)生強(qiáng)力綠色熒光的羅丹明123（rhodamine 123）。據(jù)此測(cè)定組織細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝基陰離子活性氧族的濃度。 

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）           20毫升

  染色液（Reagent B）           40微升

  稀釋液（Reagent C）           10毫升

產(chǎn)品說明書            1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent C）置于室溫預(yù)熱。然后移出10微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升  稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為  染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5片待測(cè)的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片

2． 置于室溫下，小心加上500微升預(yù)冷的  清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面

3． 小心移去切片上的  清理液（Reagent A）

4． 小心加上200微升室溫預(yù)熱的  染色工作液，鋪滿整個(gè)切片表面

5． 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)）

6． 小心移去切片上的  染色工作液，避免光照

7． 小心加上500微升  清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent A）

9． 放上蓋玻片或封片

10． 即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測(cè)）：激發(fā)波長480nm或500nm，散發(fā)波長530nm――綠色熒光增強(qiáng)，表明過氧亞硝基陰離子活性氧族（ONOO^-）含量高

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 建議使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片

3． 操作時(shí)，須戴手套

4．   染色工作液避免光照

5． 孵育時(shí)，須避免光照

6． 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光定性分析

7． 如果背景熒光強(qiáng)度過大，可以稀釋  染色工作液10至1000倍

8． 可以使用2.5微摩爾尿酸或25微摩爾半胱氨酸（cysteine），觀察細(xì)胞熒光減弱或消失現(xiàn)象

9． 本公司提供過氧亞硝基陰離子解構(gòu)劑和清除劑溶液

10． 本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰