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生物分子的分離純化是獲得有效生物產品的重要環節之一，在重組蛋白純化過程中需要考慮目的物性質，合理選擇及組合具有各自特點及優勢的層析技術，才能達到*的純化效果，滿足目標產品產量、純度等多方面的要求。蛋白的分離純化及制備過程中，會產生沉淀，這些沉淀有可逆和不可逆2種。 蛋白發生變性，指的是蛋白分子在遭到劇烈的物理化學(如高溫、pH等)作用時，分子中的次級鍵遭到破壞斷裂，導致空間構象從緊密有序的變為松散無序的狀態，這種清況下形成的沉淀是不可逆的。在蛋白鹽析、蛋白等電沉淀中最為常見的是蛋白質的水化膜遭到破壞或者中和了表面的凈電荷后形成的沉淀，這種情況下形成的沉淀是可逆的，利用這一特性可以用來分離純化蛋白。 若發生可逆沉淀后，可以嘗試通過增加溶劑，調節pH，添加助溶劑等方式來處理；若發生不可逆沉淀，則可以選擇離心，過濾等方式去除。一般下列因素會影響蛋白純化過程中沉淀的形成。 1、影響蛋白純化過程中沉淀形成的影響因素 （1）蛋白自身性質 如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易發生疏水聚合而沉淀，做過膜蛋白提取以及包涵體溶解時都有切身體會。在表達還有二硫鍵鍵的蛋白時特別容易形成包涵體蛋白，所以蛋白的氨基酸序列中，含硫氨基酸較多時也容易形成沉淀。 （2）pH值 蛋白質大多數都在高pH時溶解性高，低pH時易沉淀，這可能與氫鍵的形成有關。但有時候更低pH時蛋白又溶解了，這一現象在我們用親和層析純化抗體時特別常見。鹽濃度就是鹽析效應，高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質聚集沉淀，常用的就是硫酸銨沉淀。鹽析沉淀通常對蛋白質的高級結構沒有破壞，再溶時活性可以*恢復。常見的例子就是硫酸銨沉淀純化IgG。同樣，硫酸銨沉淀也常碰到不可逆的情況，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)表達的重組蛋白往往在硫酸銨沉淀后再溶困難。 （3）有機溶劑 例如丙酮沉淀，但有機溶劑也不是全部對蛋白起沉淀作用，有時候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有機溶劑抽提。 （4）溫度 高溫或低溫都有可能使得蛋白質沉淀。煮沸沉淀常見了，低溫沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。 （5）表面活性劑 對蛋白質有助溶作用。例如做電泳的SDS就是很強的表面活性劑，還有TWEEN，Triton等等。 （6）還原劑 還原劑往往對蛋白質有助溶作用。有些蛋白當加入的還原劑在空氣中慢慢氧化后，就會沉淀析出。變性劑如尿素、鹽酸胍，包涵體蛋白在用變性劑溶解后，再去除變性劑經常會沉淀析出。 |
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