1、如何確定引物的濃度？

前面我們說(shuō)到，引物一般交由試劑公司合成，有時(shí)候具體的濃度我們也不能確定。有些人喜歡稀釋十倍，有些人喜歡稀釋二十倍。我個(gè)人認(rèn)為比較穩(wěn)妥的做法是在每次拿到反轉(zhuǎn)的 cDNA 后，先會(huì)稀釋 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環(huán)數(shù)一般為 25 循環(huán)，鑒定一下具體濃度，再?zèng)Q定最后的稀釋倍數(shù)。

2、合成的引物是我們想要的引物嗎？

一般來(lái)說(shuō)在拿到很多引物的時(shí)候，可以通過(guò)普通的 PCR 看看是否是單一條帶，鑒定一下引物的特異性。如果實(shí)驗(yàn)室不差錢(qián)，則可以通過(guò)溶解曲線對(duì)所有的引物的特異性做一次鑒定。

3、操作過(guò)程中需要注意哪些問(wèn)題？

一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說(shuō)三遍。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差，我們一般會(huì)將樣本再稀釋一倍，加樣的時(shí)候多加一倍，減少 H2O  的加入量。

4、你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？

你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那么你一定要買(mǎi)配套該儀器的 qRT-PCR 板。因?yàn)椴患嫒莸?PCR 板會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。這種狀況實(shí)驗(yàn)小白尤其需要注意。

5、凝膠放入電泳槽有什么注意事項(xiàng)嗎？

凝膠放入電泳槽時(shí)一定要注意方向，核酸是帶負(fù)電的，所以電泳的方向是從負(fù)極向正極跑，因此，加樣孔一定要對(duì)著負(fù)極放置，不然樣本就跑到膠外面去了。