FCM數據的存貯的方式是FCS2.0(flow cytometry standard),采用列表排隊(List Mode)方式。易于加工處理分析,但缺乏直觀性,數據的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種;由數據還可以做出標準曲線進行定量分析。
Q1:坐標軸的意義?
1、 單參數直方圖
每一個細胞單參數的測量數據可以整理成統計分布,以直方圖的方式來顯示。在圖中,橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值,其單位是道數(channel),可以是線形(line)或者對數(log)。縱坐標一般是相對細胞/粒子數(count)!
2、 二維圖
在二維圖的中,橫坐標/縱坐標都表示熒光信號或散射光信號相對強度的值,可以是線形(line)或者對數(log)。雙參數圖可以將樣品細胞群分開,從而方便對感興趣的細胞進行分析。
Q2:“Gate”和 “Regin”?
設門是流式細胞分析中一種重要的技術,只有通過最佳的設門方式,才能準確地獲取和分析數據,從而得到臨床診斷和科研中有價值的信息。
On-line gating(threshold gating)監測/獲取數據
Off-line gating: 分析實驗數據 散射光設門/熒光設門 散射光/熒光聯合設門
多重邏輯門(組合門)多重邏輯門 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)
其它: G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式圖中的顏色與熒光顏色?
流式圖中的顏色為區分不同細胞群而人為指ding, 與熒光顏色無關!!
Q4:流式圖中的陰/陽(N/P)如何劃分?
如何做M1陰性界限?實際上,這個M1的劃分*是根據陰性(同型)對照來的!如下圖:左圖為同型對照,即:您所檢測的物質在陰性組中的基礎表達量,可以理解為背景、靜息狀態下、基礎水平、未受刺激時等。右圖即陽性組,也就是接受刺激后,功能狀態下、藥物作用后等。
Q5: 這么巧,陰性正好在101劃分??
其實, 我們可以人為地將電壓,放大倍數調到相應的大小,使陰性的右邊界在某一個值上,(通常劃在101附近)這樣后期做sample時好看!當然也可以調到102,103次方。
Q6:為什么要進行熒光補償?
流式細胞分析中經常要用到2種以上的熒光標記抗體進行染色,而目前所使用的多種熒光染料發射譜間有一定重疊。
“熒光補償”這個術語是指修正熒光滲漏的過程,如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。
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