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NGS建庫(kù)人都在用的文庫(kù)質(zhì)量評(píng)定方法，你都知道嗎？
高通量測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）近年來(lái)飛速發(fā)展，在各個(gè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。而文庫(kù)的制備是NGS技術(shù)中極為重要的步驟。所謂文庫(kù)制備（Library Preparation）就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過(guò)程，讓文庫(kù)可以在高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。
文庫(kù)構(gòu)建的最終目的在于成功測(cè)序，并獲得序列信息。那么如何判定這個(gè)文庫(kù)能否上機(jī)測(cè)序呢？想必這是大家一致關(guān)注的問(wèn)題。
文庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量是能否成功測(cè)序的關(guān)鍵。文庫(kù)的濃度和文庫(kù)分布是評(píng)價(jià)文庫(kù)質(zhì)量的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。
文庫(kù)構(gòu)建完成后，我們首*行文庫(kù)濃度的測(cè)定。核酸定量的方式有多種，但基于紫外分光光度的測(cè)定方法相對(duì)不夠精準(zhǔn)定量，比如Nanodrop或酶標(biāo)儀，我們推薦使用染料法進(jìn)行核酸定量，在文庫(kù)構(gòu)建中比較常用的核酸定量?jī)x器是Thermo Life Qubit 3.0熒光定量?jī)x。
如果文庫(kù)濃度符合上機(jī)需求，接下來(lái)我們用Agilent 2100生物分析儀來(lái)檢測(cè)其片段大小是否符合預(yù)期，其峰值大小應(yīng)該是目的片段加上接頭序列的總長(zhǎng)度。
除ATAC、cfDNA和small RNA等特殊文庫(kù)外，一般情況下，好的文庫(kù)應(yīng)該呈現(xiàn)出單一的、圓滑的峰且接近正態(tài)分布，并且文庫(kù)中小于280 bp和大于1000 bp的片段占比不要過(guò)大（如大于20%）都可上機(jī)測(cè)序。
圖1：常規(guī)文庫(kù)2100峰型圖
圖2：cfDNA文庫(kù)2100峰型圖
圖3：ATAC文庫(kù)2100峰型圖
圖4：文庫(kù)峰型偏大
圖5：接頭、引物殘留峰型圖
（紅色箭頭標(biāo)注為引物殘留，藍(lán)色箭頭標(biāo)注為接頭殘留）
圖9：過(guò)度擴(kuò)增峰型圖
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