堿性磷酸酶是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，是免疫診斷試劑中常用的生物標志物，也是重要的治療靶點。檢測堿性磷酸酶可用于肝臟功能異常，骨質疏松和糖尿病等疾病的診斷。常見的堿性磷酸酶底物有PNPP、BCIP/NBT組合。

PNPP：中文名稱為對硝基苯磷酸二鈉,廣泛用作ELisa檢測堿性磷酸酶的底物。原理是，堿性溶液中無色的對硝基苯磷酸二鈉（PNPP）可被堿性磷酸酶催化分解出磷酸酰基，磷酸酰基與受體物結合，生成游離的對硝基苯酚，對硝基苯酚在堿性溶液中轉變為醌式結構，呈現較深的黃色，即水溶性黃色產物。在波長405nm處檢測吸光度增高速率，則可檢測堿性磷酸酶。

對硝基苯磷酸二鈉（PNPP）還用于農藥殘留檢測、古文物膠原蛋白檢測等，也是醫藥、農藥合成領域的重要化工中間體。 

BCIP/NBT：是堿性磷酸酶的發光底物組合，其原理是在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會被水解產生強反應性的產物，該產物會和NBT發生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的產物，具有強特征性，易于捕捉分析，從而達到標記作用。

BCIP，又稱對甲苯氨藍，除作為堿性磷酸酶化學組織底物應用于生化研究、醫藥領域外，還用于食品安全檢測中。 

NBT，即氯化硝基四氮唑藍，在免疫印跡實驗中檢測堿性磷酸酶底物是其最常見的應用。此外，氯化硝基四氮唑蘭（NBT）還作為脫氫酶和其它過氧化酶的底物，用于測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶等。