對硝基苯磷酸二鈉用于酶聯接免疫吸附劑測定和常規分光光度測定的堿性和酸性磷酸酶的非蛋白質性顯色底物，是磷酸酯酶活性檢測劑。

檢測堿性磷酸酶是對硝基苯磷酸二鈉最常見的應用。堿性磷酸酶廣泛分布于人體各臟器中，而肝臟中的分布最為豐富。臨床上，堿性磷酸酶用于阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查，因此對硝基苯磷酸二鈉在肝膽相關疾病的診斷及輔助診斷中非常重要。

對硝基苯磷酸二鈉作為堿性磷酸酶檢測試劑的原理為：堿性溶液中無色的對硝基苯磷酸二鈉可被堿性磷酸酶催化，出磷酸酰基，從而生產游離的對硝基苯酚（4-NP），對硝基苯酚在堿性溶液中轉變為醌式結構，呈現較深的黃色。在波長405nm處檢測吸光度增高速率，可計算出ALP的活性單位。

對硝基苯磷酸二鈉還可用于水產品安全檢測，用于制備腹瀉性貝類毒素快速檢測試劑盒。利用腹瀉性貝類毒素在堿性條件下抑制PP2A酶催化無色底物對硝基苯磷酸二鈉去磷酸化產生黃色產物對硝基苯酚的反應，根據pNP在405nm處吸光度與毒素濃度的劑量反應關系對毒素進行定量檢測。

對硝基苯磷酸二鈉還用于食用油及含油脂食品中鄰苯二甲酸二丁酯的檢測、農藥殘留檢測、古文物匯中膠原蛋白的檢測。同時，對硝基苯磷酸二鈉也是醫藥、農藥合成領域的重要化工中間體。