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材料與儀器
骨標(biāo)本
Hams F12 培養(yǎng)液 用于細(xì)胞傳代的胰蛋白酶液 分離成骨細(xì)胞的消化液
Petri培養(yǎng)皿 培養(yǎng)瓶 手術(shù)刀 手術(shù)鑷
步驟
一、外植塊培養(yǎng)
1. 從手術(shù)室獲得骨標(biāo)本。
2. 在室溫條件下，用無(wú)菌生理鹽水浸洗骨組織數(shù)次。
3. 如果骨組織不能及時(shí)使用，將骨標(biāo)本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的 Ham’s F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素）培養(yǎng)液中。骨標(biāo)本可在 4℃條件下儲(chǔ)存過(guò)夜。
4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素的 Tyrode 液浸洗骨組織。
5. 將骨組織放入 Petri 培養(yǎng)皿，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷取骨小梁，然后將骨小梁移入另一個(gè) Petri 培養(yǎng)皿。
6. 加入 10 ml Tymde 液，淹蓋切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁數(shù)次，直至除去血液和脂肪細(xì)胞。
7. 為了進(jìn)行植塊培養(yǎng)，將 2 ml *培養(yǎng)液放入 25 cm2 培養(yǎng)瓶，預(yù)孵育 20 min，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液。根據(jù)需要，用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 調(diào)整 pH 。
8. 將骨小梁切成 1~3 mm 小塊。
9. 吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的預(yù)孵育培養(yǎng)液，然后加入 2.5 ml 新鮮的 Ham's F12培養(yǎng)液。
10. 將 25~40 塊骨小梁放入培養(yǎng)瓶。
11. 將培養(yǎng)瓶直立，用接種環(huán)沿著培養(yǎng)瓶底壁滑動(dòng)植塊，使植塊均勻分布。
12. 在 37℃條件下，將培養(yǎng)瓶直立放置 15 min。
13. 慢慢地使培養(yǎng)瓶恢復(fù)為正常的橫置位。植塊黏附于培養(yǎng)瓶底壁。
14. 在37℃ 條件下，將培養(yǎng)瓶橫置 5~7 d。此后，檢査細(xì)胞長(zhǎng)出情況，換培養(yǎng)液。為了預(yù)防植塊脫離，在將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱移于超凈工作臺(tái)內(nèi)或顯微鏡上之前，將培養(yǎng)瓶慢慢地直立起來(lái)。
15. 每周換培養(yǎng)液 2 次，以維持培養(yǎng)。
16. 細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層時(shí)，取出植塊，用胰蛋白酶（將 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca2＋ 和 Mg2＋ 的 Tyrode 液。調(diào)整 pH 至 7.0，過(guò)濾除菌。用 Pyrex 管分裝成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 條件下儲(chǔ)藏）消化細(xì)胞。通過(guò)離心分離細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。
二、分離細(xì)胞的單層培養(yǎng)
1. 用 Tymde 液反復(fù)沖洗松質(zhì)骨，洗去脂肪和血細(xì)胞。在無(wú)菌條件下，用手術(shù)刀和手術(shù)鑷切除骨小梁。
2. 取到較多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遺留的血液和脂肪細(xì)胞。將骨小梁切成 2~5 mm 小塊。
3. 用含有 FCS 的 F12 培養(yǎng)液洗骨小梁塊。
4. 將組織塊放人盛有磁力攪拌棒的無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)，然后加入 4 ml 消化液（分離成骨細(xì)胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O，用 100 ml 超純水配制。②B 液（膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：將 137 mg 膠原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。調(diào)整 pH 至 7.2，然后用超純水配成 100 ml。過(guò)濾除菌后，分裝成 10 ml，在 -20℃ 條件下儲(chǔ)藏）。加入的消化液應(yīng)淹蓋組織塊。
5. 在室溫條件下，將含有組織塊的液體攪拌 45 min。
6. 棄去細(xì)胞懸液，因?yàn)檫@些細(xì)胞中很可能含有成纖維細(xì)胞。
7. 加入 4 ml 消化液，在室溫條件下攪拌 30 min。
8. 收集消化液，在室溫條件下離心（580 g，2 min）。
9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞。
10. 將細(xì)胞懸液離心（580 g，10 min）后，用 4 ml *培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液作為接種物。
11. 將 75 cm2 培養(yǎng)瓶用 8 ml * F12 培養(yǎng)液預(yù)孵育 20 min，以便用培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體平衡培養(yǎng)液。
12. 吸去預(yù)孵育培養(yǎng)液，然后加入 2 ml *F12培養(yǎng)液。
13. 加入 4 ml 細(xì)胞懸液，接種密度為 6000~10000 個(gè)/cm2。
14. 最后加入 6 ml F12培養(yǎng)液，使總量成為 12 ml。
15. 在分離細(xì)胞期間，向剩余的骨組織塊加入 4 ml 消化液，重復(fù)消化 30 min 。
收集分離下來(lái)的細(xì)胞。如有必要，重復(fù)消化幾次。骨組織多時(shí)，消化時(shí)間可延長(zhǎng)至 1~3 h 。每次消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞，將分離的細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞傳代
1. 取出植入的組織塊。
2. 吸去培養(yǎng)液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm2）浸洗細(xì)胞。
3. 向培養(yǎng)瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm2），在 37℃ 條件下孵育，直至細(xì)胞脫離瓶壁，且細(xì)胞彼此分離。用顯微鏡觀察細(xì)胞的脫離和分離。一般孵育 10 min 即可。
4. 將分離的細(xì)胞移入離心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培養(yǎng)液。
5. 離心（600 g，5 min）。
6 . 吸去上清液，用*培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞，反復(fù)吹打。
7 . 留兩份細(xì)胞份用于確定細(xì)胞密度，另一份用于 DNA 檢測(cè)。
8. 將剩余的細(xì)胞接種于先前用培養(yǎng)液平衡的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。細(xì)胞可在 24 h 內(nèi)貼壁。
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