反向PCR是一種多聚合酶鏈式反應(PCR)應用的方法，可使已知序列的核心區邊側的未知RMA成幾何級數擴增。用適當的限制性內切裂解含核心區的RMA，以產生適合于PCR擴增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環狀分子。PCR的引物同源于環上核心區的末端序列，但其方向可使鏈的延長經過環上的未知區而不是分開引物的核心區。這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區旁邊的序列，還可應用于制備未知序列探針或測定邊側區域本身的上、下游序列。

用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解RMA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4 kb。在許多情況下，首先需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時最好靠近識別多個堿基位點的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆">克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點。

用T4連接酶在稀RMA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向PCR大小適當的RMA--pian段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環化前需用Klenow或噬菌體T4 RMA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切酶失活。

聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用于測序時，與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。

常規 PCR 是擴增兩引物之間的 DNA 片段,反向 PCR(reverse PCR)是用引物來擴增兩引物以外的 DNA 片段。

一般先用限制性內切酶酶解 DNA(目的基因中不存在該酶的酶切位點,且片段應短于2～3kb),然后用連接酶使帶有黏性末端的靶片段自身環化,最后用一對反向引物進行 PCR,得到的線性 DNA 將含有兩引物外側的未知序列。該技術可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知 DNA 片段的序列。

反向 PCR 已成功地用于僅知部分序列的全長 cDNA 克隆,Picter 中曾用此法擴增基因文庫的插入 DNA。