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大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)——酶消化法
材料與儀器
Wistar大鼠乳鼠
FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精
眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
步驟
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，經(jīng)75%酒精消毒，斷頭處死。
2. 取腦放入冷的D-Hanks'平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。
3. 分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 rpm，10 min)，去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，經(jīng)75μm篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再次離心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5x106/ml，種植于75 cm2 培養(yǎng)瓶。
6. 經(jīng)1 小時(shí)差速黏附去除成纖維細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm2 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，兩天換液一次。
7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h，37℃)，換液棄除小膠質(zhì)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱平衡1 小時(shí)，重新置于水平搖床18 h。
8. 換液棄除少突膠質(zhì)細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化、傳代備用。
二、 形態(tài)學(xué)觀察
倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。
倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。
三、 細(xì)胞生長曲線繪制
傳代后的細(xì)胞以 2x104/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 天換液1 次， 每24 小時(shí)取3 孔計(jì)數(shù)，連續(xù)7 天，取均值繪制生長曲線。
傳代后的細(xì)胞以 2x104/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 天換液1 次， 每24 小時(shí)取3 孔計(jì)數(shù)，連續(xù)7 天，取均值繪制生長曲線。
四、星型膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定
膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞組織化學(xué)鑒定方法。取星型膠質(zhì)細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時(shí)，PBS洗3 次，每次5 分鐘，0.3% H2O2 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時(shí)，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，DAB顯色。
五、結(jié)果膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞組織化學(xué)鑒定方法。取星型膠質(zhì)細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時(shí)，PBS洗3 次，每次5 分鐘，0.3% H2O2 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時(shí)，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，DAB顯色。
1. 形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下，傳代的星型膠質(zhì)細(xì)胞折光性強(qiáng)，形狀不規(guī)則，主要為多角形，胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核圓形或卵圓形，偏于胞體一側(cè)，內(nèi)有1-2 個(gè)核仁，有多個(gè)粗短枝狀初級(jí)胞突，部分細(xì)胞突起變細(xì)變長，6-7 天后細(xì)胞融合成單層，符合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長特性，如下圖。
星型膠質(zhì)細(xì)胞單層生長(x100)
圖1：星型膠質(zhì)細(xì)胞形成融合狀，單層生長(x200)
3. 細(xì)胞生長曲線繪制如下：
2. 鑒定：細(xì)胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細(xì)胞漿著色，而胞核未見著色，見下圖，證明采用上述方法獲得的細(xì)胞為星型膠質(zhì)細(xì)胞，純度高， 可用于實(shí)驗(yàn)。
圖2：免疫組化鑒定，GFAP 染色
3. 細(xì)胞生長曲線繪制如下：
圖3：細(xì)胞生長曲線
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