最初接觸基因克隆和構建載體時，總會遇到這樣那樣的問題，構建載體作為很多實驗的必須步驟，不應該成為阻擋后續實驗的障礙。這是因為通常來說，載體構建相關的問題都過于簡單，下面就來了解一下！

構建載體常出現的問題
1、無法成功克隆到基因
2、基因無法成功連接至載體
3、檢測質粒時發現目的基因大小不對
4、檢測質粒時發現大小差不多，但測序結果不對

一般，在構建載體時，能遇到的也就這幾個問題，如果有其他問題存在也大概與上述四個問題是密切相關的。需要說的是，如果載體構建出了狀況，就不要一味的重復了，一遍不成功，十遍也絕不會對。如果出現例外，那是小概率事件。

那出現上述問題后從哪幾方面思考呢？
1、確保克隆到的基因*正確：
如果這一步出問題，無非兩點原因：引物設計不合理，模板質量不高。
解決方法：多找幾個模板同時進行克隆；重新評估引物的合理性和特異性，比如將引物長度增至40 bp左右。

2、關于酶切
酶切其實要求并不十分嚴格，正常操作下，不論電泳檢測是否十分清楚，酶切產物足夠連接用量了，沒必要糾結。

3、關于酶切位點的選擇
這一點很重要。通常很多同學在選擇酶切位點時，會習慣性的選擇師兄師姐們常用的酶切位點，比如BamHI等，但實際上這樣是不行的。此時需要注意：目的基因中不能出現所選酶切位點，否則，在連接時，殘留的酶會對目的基因進行切割，這將直接導致實驗的失敗。
解決辦法：選擇酶切位點前，需要檢查所選酶切位點是否存在于目的基因中。

小結
總之，如果構建載體時出現問題，就從這幾方面一一排除：
引物設計是否合理？
酶切位點是否選擇正確？
模板質量是否較好？
PCR程序是否設置正確？
如果以上幾點都沒問題，那載體構建就不會出問題。
最后，其實不管構建載體還是其他實驗，有時做不出來，排除最本質的原因之外，如果正常操作下出現狀況，一定是哪一步做錯了或者疏忽了，應該盡量避免一味的機械重復。