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避免RNase污染,可以這么做...

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2021年12月30日 16:39  
避免RNase污染,可以這么做...



RNase的來源



• 自然界中許多生物會自主分泌RNase

RNase是生物體的“保護傘”,可防止外源RNA入侵。如:生物眼淚、唾液、汗液等體液中均會分泌RNase。

• 環(huán)境中的RNase穩(wěn)定性非常好

環(huán)境中存在的RNase主要是由微生物(細菌和真菌)所分泌,由一種微小緊湊的蛋白組成。它的結構中具有二硫鍵,因此具有穩(wěn)定性極強的天然屬性,極難滅活,熱變性后也可以很快恢復構象。并且,RNase耐熱、耐酸、耐堿,因此,它對眾多去污方法均具有抵抗作用。

檢測RNase污染的小Tips



由于RNase污染而導致實驗失敗,如何有效檢測RNase污染源,是令實驗人員頭疼的事情。建議從以下幾點進行排查:

• 檢測緩沖體系、溶液:可啟用全新批次的RNase-free試劑測試比對,也可檢測疑似污染溶液中的RNase。

• 檢測RNA樣品:RNase進入RNA樣本可在多種情況下發(fā)生,如RNA分離時(少量RNase在RNA制備過程中引入),或日常取用時(會不可避免地需要重復開關樣品管并插入可能被污染的加樣槍頭)。

• 可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等管家基因的探針,通過northern分析來評估poly(A) RNA樣品的完整性


從源頭開始,避免RNase的污染



RNase的無處不在,使得實驗過程中,難以保存RNA樣本的完整性。因此,可以從源頭入手,一方面要嚴格控制外源性RNase的污染,另一方面要最大限度地抑制內源性的RNase。

常見的污染源及其控制方法:

外源性


外源性污染源:

體液、水與緩沖液等溶液,槍頭,離心管。


控制外源性RNase污染的方法:


操作人員全副武裝

在實驗過程中戴手套可避免源自人手的RNase污染;觸摸皮膚、門把手及普通物體表面后更換手套;

使用專業(yè)儀器與試劑

RNA操作專用的移液槍;使用RNase-free的槍頭和離心管;使用RNase-free的化合物與試劑;

選擇實驗操作環(huán)境

遠離/遮蔽通風孔或開放窗口,走動較少的區(qū)域作為RNase-free區(qū)域;

其他注意的點

在RNA提取和分析期間,不要進行其他可能引起RNase 污染的實驗。



內源性


內源性污染源:

所有組織樣品均含有內源性RNase。


抑制內源性RNase活性的方法:


樣本保存

組織取樣后若不直接提取RNA,要及時用液氮迅速冷凍存于-80°C環(huán)境,并盡早進行實驗,這樣可使RNA的降解達到最少。

添加抑制劑

在細胞裂解液中加入RNase 抑制劑RNase inhibitor,使破碎細胞與滅活RNase 同步進行,最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNase 的活性。

RNase抑制劑可有效避免RNase污染


RNase 抑制劑的類別較多,常用的RNase抑制劑有以下幾類:


關于RNasin



RNasin能夠保護mRNA的完整,有利于提高轉錄及翻譯的效率,同時避免了使用有機化合物抑制劑可能帶來的影響。

RNasin是從人胎盤或大鼠肝中提取的一種特異的酸性糖蛋白。其分子量為51 kDa,等電點pH值為4.7。RNasin對RNase A、RNase B或RNase C抑制能力極強,可快速特異地與它們以非共價鍵結合形成1:1的復合物,從而抑制RNase的活性,防止RNA被其降解。但需注意,RNasin不能抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。

目前,RNasin主要用于cDNA合成,體外轉錄,體外翻譯,以及mRNA-protein復合物分離純化等過程中保護RNA不被降解;還可用于特定RNase活性的鑒定等。

翌圣生物提供高質量鼠源RNase Inhibitor



翌圣生物科技(上海)股份有限公司(以下簡稱“翌圣生物”)提供全面、高品質、高性價比的分子酶原料。翌圣生物的鼠源RNase Inhibitor,可用于RT-PCR/RT-qPCR,解決體外轉錄中RNA降解問題,抑制RNA分離純化過程中RNase的活性。

產(chǎn)品特點 ?

• 可以抑制RNase A、B和C

• 與 Taq 聚合酶、AMV 或 M-MLV反轉錄酶兼容

• 與人源RNase inhibitor相比,具有更高的抗氧化活性

• 適合于對高DTT敏感性實驗(如RT-qPCR等)

活性定義 ?

抑制5 ng RNase A活性的50%所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。RNase A活性通過水解Cyclic 2’,3’-CMP生成3’-CMP定量求得。

部分案例展示 ?

在相同實驗條件下,以qPCR方法分別對翌圣和R*公司的鼠源RNase抑制劑(MRI)的抑制效果進行檢測,其結果如下圖所示:


003.jpg


綜合以上結果,翌圣鼠源RNase抑制劑能有效抑制體系中的RNaseA,抑制效果優(yōu)于競品。

翌圣生物持續(xù)致力于開發(fā)分子診斷酶原料,并為客戶提供相對應的支持,努力為您的工作和公共衛(wèi)生事業(yè)做出貢獻。

翌圣生物主要分子診斷酶原料



原料類型

描述

產(chǎn)品名稱

貨號

單酶原料

鼠源RNase抑制劑

Murine RNase Inhibitor (40 U/µL)

10603ES

熱啟動聚合酶

Hieff UNICON® HotStart Direct Taq DNA Polymerase

10717ES

Taq酶單克隆抗體

Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31301ES

Taq酶單克隆雙封閉抗體

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES

第五代耐熱逆轉錄酶

Hifair® V Reverse Transcriptase

11300ES

熱敏UDG

Uracil DNA Glycosylase (UDG), heat-labile

10303ES

Bst II DNA聚合酶

Bst II DNA polymerase

12908ES




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