引物合成儀合成步驟:
1、脫掉附加在CPG擔體上的第一個堿基5' -OH基團上的保護基 (DMTr),準備附加下一個新的堿基;
2、活化新的堿基單體,準備與第一個堿基進行反應;
3、第二個堿基與第一個堿基發生偶聯反應;
4、將沒有反應的第一個堿基的5' -OH加帽封死 ,使其不再進一步參與反應;
5、將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯 (即將三價磷氧化成五價磷)。
6、重復進行1~5的循環,直至合成完所需的Oligo DNA序列。
7、合成結束后,將Oligo DNA分子從CPG上切下,再進行進一步的純化。
引物合成儀溶解和保存引物的方式:
干燥后的引物質地非常疏松,開蓋前最好離心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或 10mM Tris pH7.5 緩沖液,室溫放置幾分鐘,振蕩助溶,離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水,因為有些蒸餾水的 pH 值比較低( pH4-5 ) , 引物在這種條件下不穩定。
引物合成后,經過一系列處理和純化步驟,旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前,室溫狀態下可以長期保存。溶解后的引物 -20 度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高,合成的 OD 數較大,建議分裝,避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。
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