Protein A+G瓊脂糖凝膠說明書

Protein A+G Agarose  

Cat. No.   K0349    

保存：2-8  ℃

組分說明

                                              Cat.No.         K0349

                                              Volume         2 ml

產品簡介

       本產品為Protein A 和  Protein G  共價交聯到4% Agarose beads 上的產物，并保存在含有0.05%疊氮鈉的TBS 緩沖液中，2 ml Protein A+G Agarose 中共含有 0.5 ml Agarose beads，約2 mg 重組的Protein A+G。主要用于免疫沉(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。適用于免疫沉淀所有Protein A Agarose 和Protein G Agarose 單獨可以免疫沉淀的抗體，包括Mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, Rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, Rabbit IgG, Rabbit and Goat polyclonal Abs，以及Human IgG1, IgG2,IgG3 和IgG4。本產品如果用于常規的免疫沉淀，可以免疫沉淀100 次。

注意事項

1. 請勿冷凍保存本產品。

2. Protein A+G Agarose 使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。

3. 從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1.  免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

1.1.  蛋白樣品的準備：

1.1.1  對于10 cm細胞培養皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養液，PBS洗滌一次，然后加入500  μl至2 ml細胞裂解液裂解細胞。

1.1.2.  對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。

1.1.3.  對于懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。

      注：  詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量。

1.2.  去除非特異性結合(可選做)：

1.2.1.  取200  μl至1 ml蛋白樣品，蛋白量約為200  μg至1 mg，加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20  μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。

1.2.2. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鐘，取上清用于后續的免疫沉淀。

       注：  所謂種屬相同的IgG是指，例如后續免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG可以加入其它不影響后續檢測的其它mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特異性的結合，降低背景。

1.3.  免疫沉淀：

1.3.1.  加入0.2-2 μg用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動過夜。

1.3.2.  再加入20 μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動1-3個小時。(為方便后續的洗滌操作可以把加入充分重懸的Protein A+G Agarose的量調整為40微升。)

1.3.3. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鐘，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。

1.3.4.  用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1 ml。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟C3。

1.3.5.  完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40  μl 1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底。

1.3.6. 100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20℃保存。

2.  免疫共沉淀：

   參考免疫沉淀的方法進行，但免疫共沉淀(CO-IP)通常必須使用未經凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。

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