手機版
化工儀器網(wǎng)手機版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關(guān)注視頻號
原理
長期標記意味著對細胞進行 6～32 h 持續(xù)的代謝標記。該方法特別適用于研究合成速度相對較慢的蛋白質(zhì)或研究成熟的標記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標記是長期標記的一種形式，在此過程細胞和放射性標記的氨基酸一起孵育直至放射性標記蛋白的合成和降解速率相當(dāng)。如果蛋白質(zhì)復(fù)合體中的亞基的初級結(jié)構(gòu)已知，該方法可以對這些亞單位進行化學(xué)計量。所加入的未標記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標記的時間和細胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有 5％～20％ 正常的非標記甲硫氨酸含量。
材料與儀器
細胞懸液／貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 長期標記培養(yǎng)基
75 cm2 組織培養(yǎng)瓶
步驟
1. 在預(yù)熱的 37℃ 長期標記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。
2.1 對于懸浮細胞：用預(yù)熱的長期標記培養(yǎng)基準備并洗細胞一次（見基本方案步驟 2）。
在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重懸 0.5 ×107～2 ×107 細胞，并轉(zhuǎn)移到 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中。
2.2 對貼壁細胞： 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中生長 0.5 ×107 ～2 ×107 的貼壁細胞（80% ～90%融合），在 CO2 培養(yǎng)箱中。用預(yù)熱的長期標記培養(yǎng)基洗細胞一次（見備擇方案 1 步驟 3）。每個 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液。
3. 擰緊蓋子以防 [35S] 標記的化合物揮發(fā)。在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 16 h。
4. 洗細胞并測定摻入量（見基本方案步驟 5～7；或備擇方案 1 步驟 6～8）
注意事項
常見問題
同實驗其他方法
氨基酸代謝標記實驗
1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~
備擇方案 1 對貼壁細胞
1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1
備擇方案 2 示蹤標記細胞
1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和多種免疫細胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細胞治療的生物科技企業(yè)。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購中心