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高效液相色譜系統使用液體作為流動相，采用高壓輸液系統將不同極性的單一溶劑或流動相，如不同比例的混合溶劑和緩沖液，泵入裝有固定相的色譜柱中。色譜柱中的組分分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現樣品的分析。
高效液相色譜系統根據分離機制的不同，HPLC原理可分為離子交換色譜法、分子排阻色譜法及液液分配色譜法。
1、離子交換高效液相色譜法：
固定相是離子交換樹脂。樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
2、分子排阻色譜法：
分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩定性，利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。根據所用流動相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法(GFC)與用有機溶劑如THF做流動相的凝膠滲透色譜法(GPC)。
3、液液分配色譜法：
固定相為液體，根據被分離的組分在流動相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法采用極性固定相，流動相為相對非極性的疏水性溶劑，常用于分離中等極性和極性較強的化合物；高效液相色譜系統法一般用非極性固定相，流動相為水或緩沖溶液，適用于分離非極性和極性較弱的化合物。
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