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共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測前的關鍵步驟。樣品需經熒光探劑標記(單標、雙標、三標)。
標本可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養，細胞應培養在Confocal專用小培養皿或蓋玻片上，懸浮細胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm，使用的蓋玻片厚度應小于0.17mm，載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間，而且表面光潔，厚度均勻，沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
常規樣品制備要求：
1、染料的選擇
由于共聚焦顯微鏡是以單一波長的激光作為光源，因此在選擇熒光染料時要根據共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇，如果在同一樣品中有多種熒光染料標記，還要考慮它們的發射波長盡量不要重疊，避免串色問題。
2、樣品承載物的選擇
一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡，它的數值孔徑較小，要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm，因此如果觀察樣品為貼壁細胞或組織切片，可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細胞或懸浮粒子，可以用共聚焦顯微鏡專用的培養皿承載樣品進行觀察。
3、封片劑的選擇
如果樣品只需要觀測一次并且不是極易淬滅的熒光，可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時間并多次拍攝，應選用抗熒光淬滅的封片劑，以減少熒光信號丟失。
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