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高能熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發光、激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。
鑒于發光水平較低，物鏡在顯微鏡中的作用至關重要，因為它是從樣品中收集光的物鏡功能。物鏡接受的光錐角度由物鏡的數值孔徑決定。在透射光熒光顯微鏡中，到達眼睛或其他探測器的光強度直接變化為物鏡和聚光器的數值孔徑的平方與總放大倍數的平方成反比。
高能熒光顯微鏡的規則是保持光學元件*沒有灰塵，污垢，油，溶劑和任何其他污染物，顯微鏡應保存在低振動無煙室內，盡可能清潔并且對循環空氣的干擾小。不使用時，請在顯微鏡上使用防塵罩，并將所有配件放在不透氣的容器中，避免使用腐蝕性溶劑清潔顯微鏡的任何部分，并僅使用稀釋的肥皂水清潔非光學表面。
高能熒光顯微鏡切勿以高壓力（包括鏡頭紙）在鏡頭表面上拖動任何物體，以避免在表面上引入非常細小的劃痕，使用專為光學表面設計的溶劑清潔鏡頭，或在緊急情況下使用無水乙醇清潔鏡頭。避免使用其他溶劑，因為它們可能會與玻璃上的光學涂層反應。在用溶劑清潔之前，用壓縮氣體對鏡頭表面進行除塵，以去除松散的顆粒，用鏡頭紙擦去多余的溶劑，讓鏡頭*干燥，重復此過程。
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