

感受態,是指宿主細胞最容易接受外源基因并實現將其轉化的一種生理狀態,它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡以及外界環境因子的影響, 比如Ca2+就可以大大促進轉化的作用。細胞的感受態一般出現在對數生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感受態細胞和進行成功轉化的關鍵。

制備感受態細胞的方法是用預冷的CaCl2處理對數生長期的細菌,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長(進入對數生長期)的細菌,從而獲得感受態細胞。此時細胞膨脹成球形,外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細胞表面,通過熱激處理促進細胞對外源DNA分子的吸收。轉化效率非常高。此方法的關鍵在于選用的細胞必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫無菌環境下進行。
儀器:超凈工作臺,搖床,高壓滅菌鍋,培養箱,制冰機,超低溫冰箱,離心機,接種環,試管,搖瓶(2L),平板,移液槍,槍頭,離心管(500mL),EP管(1.5mL),藍蓋瓶,泡沫箱
試劑:CaCl2溶液:PIPES 1.51g,CaCl2•2H2O 4.41g,甘油 75ml,pH=7.0,定容至500ml。
LB培養基(固體、液體):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固體培養基加入1.5%的瓊脂)
抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四環素。
材料:感受態菌株
取-80℃凍存的感受態菌株,用接種環劃線分離接種于固體平板上(平板抗性根據感受態選擇),做好標記,倒置于37℃培養箱培養過夜。 第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有4ml LB培養液(抗性根據感受態選擇)的試管中,37℃,195rpm,震蕩培養過夜。次日取菌液4ml接種至含有400ml LB培養基(抗性根據感受態選擇)的2L搖瓶中,37℃,200rpm震蕩培養約2-3小時。 當菌落OD600nm值達到0.3-0.5時,將搖瓶取出放置于冰上10-15min。在無菌條件下把菌液倒入500ml的預冷的離心管中,離心4℃,3000r,8min。 棄去上清,加入約200ml的預冷的CaCl2溶液,吹打混勻,懸浮菌體,放入冰浴30min。 離心4℃,3000r,8min,棄去上清,加入約8ml預冷的CaCl2溶液,重新懸浮菌體。 將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5ml的EP管中,每管110ul,保存于-80℃的超低溫冰箱中。
隨機取1支本次制備的感受態細胞,轉化一個以前轉化成功的質粒,從轉化平板上的菌落數及表達鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現其他的雜帶及蛋白表達情況)判斷感受態的效價。如果效價好,這批感受可以用;否則,要重新制備。

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