目前大多數蛋白質純化方法都使用帶有親和功能的瓊脂糖珠，例如IM谷胱甘肽或抗體。這些官能團的選擇取決于要純化的目標蛋白質，并且種類繁多，包括可以與生物分子偶聯的預官能化磁珠。

瓊脂糖常用作蛋白質純化的基質，其原因有兩個。首先，瓊脂糖顯示出與蛋白質非常低的非特異性結合，從而提高了洗脫的蛋白質組分的純度。其次，瓊脂糖顆粒整體上由親水的三維網狀結構組成，其大小足以使蛋白質擴散。該網孔首先使生物分子能夠與瓊脂糖顆粒的外殼相互作用，從而在官能團和目標蛋白質之間提供較大的相互作用比表面，并提高在蛋白質純化中可獲得的產量。

瓊脂糖基質既可以是非磁性的，也可以是利用磁鐵礦（Fe3O4）核來使其具有磁性的。非磁性瓊脂糖微球通常比磁性微球大（直徑40-150μm），以降低色譜中的背壓。磁珠通常較小（直徑為2-40微米）。較小的微球可提供更多的表面積，因此與目的蛋白質有更強的相互作用。然而，為了獲得好的磁性，應使用的最小尺寸為10μm的磁珠，特別是在使用亞鐵磁珠時。

為了獲得靈活性、磁性和非磁性材料之間的親和功能以及表面化學性質應相同，以便在兩個系統之間輕松切換。

非磁性和磁性瓊脂糖珠之間的主要區別是它們與周圍介質的分離方式。在純化步驟中，該培養基可以是細菌或細胞裂解液，細胞培養基或任何種類的生理緩沖液。在蛋白質純化的洗滌和洗脫步驟中，該培養基包含了具有不同特性（例如鹽濃度、pH）的緩沖液，這些緩沖液會誘導特定蛋白質的結合，污染物的去除和目標蛋白質的洗脫。這些溶液的粘度也可以變化，例如當添加甘油等物質以減少非特異性結合時。每個蛋白質純化過程都需要幾個分離步驟，因此有效的分離對處理時間和純化的成功都有很大影響。

對于所有蛋白純化實驗，重要的是將親和微球的量調整至與起始材料中蛋白的量相匹配。這不僅因為成本原因很重要：親和力基質太少會導致溶液中蛋白質的不*結合。另一方面，過多的親和力結合位點將導致其他蛋白的結合，從而使純化的特異性降低，因此就需要額外的純化步驟才能獲得較純的蛋白。

非磁性瓊脂糖珠可以通過離心，在重力柱中或在色譜系統上通過過濾從培養基中分離出來。在這些方法之間切換（例如當使用更高的純化規模時）需要進行優化。當蛋白質表達水平低時，需要將大量的起始材料應用于相當少量的瓊脂糖微球，這可能是一個耗時的過程。對于僅需要微升體積且非常敏感的應用（例如免疫沉淀），分離可能會不*，從而導致材料損失或瓊脂糖微球污染。

圖 2. IDA 與 NTA 螯合配體次氮基三乙酸（NTA）和亞氨基二乙酸（IDA）提供多聚組氨酸標簽的 Ni2 +  和咪唑環之間的相似相互作用，但 NTA 使 Ni2 + 具有 4 個價態而IDA 僅具有 3 個（橙色圓圈）。這種差異會影響所得純化蛋白級分的質量。

對于磁珠，無論應用和體積如何，分離原理都是一樣的。測試反應或免疫沉淀等敏感應用可以在幾微升內完成，甚至可以在微升機器人上實現自動化。從數升培養基或細胞裂解液中純化蛋白質同樣可以做得很好，因為在步分離后處理量顯著減少。

作者：德國Cube Biotech公司運營總監 Roland Fabis博士

Roland Fabis博士在德國明斯特大學獲得無機化學博士學位，他在那里研究有機硅化合物，硅烷的表面改性以及這些物質的應用。Fabis博士于1995年加入位于德國希爾登的QIAGEN總部，在基礎研究，產品開發和技術轉讓（尤其是磁性粒子合成和蛋白質純化領域）中擔任過多個職位。他也是Cube Biotech的共同創始人之一，負責蛋白質親和材料的開發和生產，包括磁珠的生產。