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反相色譜柱是指利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據溶質極性(疏水性)的差別進行溶質分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋，表現出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質的洗脫分離。
反相色譜柱在使用前，醉好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照C4反相色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是醉佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
①醉好使用流動相溶解樣品。
②使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
?、凼褂?.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
?、倭鲃酉鄬悠肪哂幸欢ǖ娜芙饽芰ΓＷC樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
?、诹鲃酉嗯c樣品不產生化學反應c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
?、哿鲃酉嗟奈锘再|要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，醉好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
?、芰鲃酉喾悬c不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
?、拊诹鲃酉嗯渲坪煤?，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的C4反相色譜柱，要追求醉佳柱效，醉好使用醉佳流速。對內徑為4.6mm的C4反相色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當選用醉佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
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